心血管疾?。–VD）死亡率居高不下，大多數(shù)與CVD相關(guān)的死亡是由心肌梗塞或中風(fēng)引起的。血栓形成和心血管事件的主要原因是動脈粥樣硬化，這是一種炎癥性疾病，可以長期保持無癥狀。故，在此領(lǐng)域迫切需要預(yù)先診斷和治療。動脈粥樣硬化斑塊含有自身抗體，動脈粥樣硬化與自身免疫之間存在聯(lián)系。然而，動脈粥樣硬化期間的免疫原性觸發(fā)和自身抗體反應(yīng)尚不清楚。

來自西班牙Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC)的研究人員進(jìn)行了動脈粥樣硬化相關(guān)抗體庫的高通量單細(xì)胞分析。在動脈粥樣硬化Ldlr^-/-和對照小鼠1700多個B細(xì)胞的抗體進(jìn)行基因測序，動脈粥樣硬化的背景下鑒定出了56種抗體，這些抗體是由B淋巴細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò)增克隆表達(dá)的。三分之一的擴(kuò)增抗體對動脈粥樣硬化斑具有反應(yīng)性，表明病變中的各種抗原可觸發(fā)抗體反應(yīng)。確定了ALDH4A1（一種參與脯氨酸代謝的線粒體脫氫酶）作為這些自身抗體之一A12的靶抗原。

動脈粥樣硬化期間的抗體免疫反應(yīng)

為了研究與動脈粥樣硬化相關(guān)的抗體免疫反應(yīng)，研究人員使用了Ldlr^-/-小鼠，喂食高脂飲食（HFD）發(fā)展動脈粥樣硬化。B細(xì)胞通過類開關(guān)重組（CSR）和體細(xì)胞超突變（SHM）經(jīng)歷二級抗體多樣化，并發(fā)展為記憶B細(xì)胞和高親和力漿細(xì)胞。Ldlr^-/-HFD小鼠顯示類轉(zhuǎn)換抗體的同種型分布偏斜，其中IgG2亞型比例較高，而IgG3亞型比例較低，SHM負(fù)荷較高。因此，動脈粥樣硬化與生發(fā)中心B細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)有關(guān)，其特征是SHM負(fù)荷增加和IgG2偏倚增加。

動脈粥樣硬化小鼠克隆的抗體顯示出斑塊反應(yīng)性

進(jìn)一步確定動脈粥樣硬化相關(guān)抗體是否識別斑塊病變。從Ldlr^-/-HFD小鼠克隆的抗體中有三分之一（18/56）對動脈粥樣硬化斑塊具有反應(yīng)性，而Ldlr ^/ ND小鼠的抗體只有8％（2/25）。自身反應(yīng)性抗體顯示出斑塊反應(yīng)性的多種模式。這些結(jié)果表明，動脈粥樣硬化期間的體液免疫反應(yīng)靶向動脈粥樣硬化斑塊中的多種抗原。為了研究與動脈粥樣硬化相關(guān)的抗體應(yīng)答的特異性，研究者集中于抗體A12，該抗體在Ldlr^-/-HFD小鼠的主動脈竇中顯示出強(qiáng)烈的噬斑反應(yīng)性。A12的斑塊反應(yīng)性在疾病進(jìn)展期間增加，并且大部分在細(xì)胞外。值得注意的是，克隆相關(guān)抗體A8也顯示出較強(qiáng)的噬菌斑反應(yīng)性。A12靶抗原可以在脾臟中循環(huán)或在脾臟中表達(dá)，并可能參與觸發(fā)反應(yīng)，且A12抗原分布或表達(dá)的變化不僅限于動脈。值得注意的是，A12還顯示出與人類動脈粥樣硬化病變的反應(yīng)性。因此，A12識別在小鼠模型和人類的動脈粥樣硬化過程中異常表達(dá)的抗原。

ALDH4A1是動脈粥樣硬化中的B細(xì)胞自身抗原

下面來確定A12的抗原特異性。用A12免疫沉淀Ldlr^-/-HFD或Ldlr ^/ ND小鼠的總主動脈提取物，進(jìn)行了高通量質(zhì)譜分析。作為特異性的對照，分析了與動脈粥樣硬化和對照小鼠克隆的其他抗體（A10，A11，D7CT，E9CT）以及與動脈粥樣硬化無關(guān)的B1-8抗體的免疫沉淀。只有A12，特異性沉淀醛脫氫酶4家族成員A1（ALDH4A1）。A12還從對照野生型主動脈中沉淀出ALDH4A1，表明A12不識別特定于動脈粥樣硬化的新表位。值得注意的是，抗ALDH4A1抗體在Ldlr^-/-HFD和Apoe^-/-HFD小鼠血漿中的滴度很高，但在對照中卻沒有，它們在動脈粥樣硬化的進(jìn)展過程中積累。此外，用ALDH4A1免疫野生型或Ldlr^-/-小鼠會觸發(fā)T細(xì)胞依賴性免疫反應(yīng)和抗ALDH4A1 IgG1抗體的積累?？傊?，這些結(jié)果確定了ALDH4A1為A12的靶抗原，并表明ALDH4A1可以引發(fā)T細(xì)胞依賴性抗原特異性免疫反應(yīng)，這與高抗ALDH4A1 IgG血漿滴度相關(guān)。ALDH4A1在Ldlr^-/-HFD小鼠的血漿和人類的動脈粥樣硬化組織中含量很高。此外，對一組頸動脈粥樣硬化患者的分析顯示血漿ALDH4A1顯著升高。這些患者的血漿ALDH4A1與動脈粥樣硬化的存在相關(guān)，而與傳統(tǒng)的危險因素和C反應(yīng)蛋白（CRP）水平無關(guān)。因此，高循環(huán)的ALDH4A1與動脈粥樣硬化密切相關(guān)，表明ALDH4A1具有作為疾病的生物標(biāo)志物的潛力。

A12輸注延遲Ldlr^-/-HFD小鼠的動脈粥樣硬化進(jìn)展。

最后研究A12抗體對動脈粥樣硬化進(jìn)展的影響。對Ldlr^-/-HFD小鼠進(jìn)行了靜脈內(nèi)連續(xù)注射；為了進(jìn)行比較，給小鼠注射了PBS或B1-8 IgG2b同型對照抗體。經(jīng)過HFD和常規(guī)抗體治療12周后，與用mB1-8-IgG2b對照抗體或單獨使用PBS治療的小鼠相比，用mA12-IgG2b治療的小鼠斑塊較小。盡管沒有檢測到斑塊的細(xì)胞或膠原蛋白成分存在質(zhì)的差異，但用mA12-IgG2b處理的小鼠血漿中的游離膽固醇和LDL含量較低。值得注意的是，經(jīng)過A12處理的小鼠碳水化合物，氨基酸和脂質(zhì)代謝以及免疫系統(tǒng)和炎癥途徑相關(guān)的蛋白質(zhì)發(fā)生特定變化，也發(fā)現(xiàn)了幾種脂質(zhì)代謝途徑的改變，包括花生四烯酸（炎性介質(zhì)的前體）的代謝以及各種甘油三酸酯的減少。用A12治療對肝臟中的脂質(zhì)和免疫途徑有很強(qiáng)的影響，這可能與在A12治療的小鼠中觀察到的全身脂質(zhì)改變有關(guān)?？傊?，這些結(jié)果表明，用抗ALDH4A1  A12抗體治療減少了動脈粥樣硬化的進(jìn)展并改善了脂質(zhì)分布。

動脈粥樣硬化是血栓形成的主要潛在原因，其漫長的無癥狀期使得識別心血管事件風(fēng)險對于提高心血管疾病的預(yù)防、預(yù)測、診斷和預(yù)后非常重要。這項研究表明，A12及其靶抗原ALDH4A1分別是該疾病的假定治療和診斷工具。