Microbiome:利用Nanopore高通量測(cè)序技術(shù)解析污水處理體系可移動(dòng)抗性基因組

香港大學(xué)張彤教授團(tuán)隊(duì)，利用三代Nanopore高通量測(cè)序技術(shù)解析了污水處理體系可移動(dòng)抗性基因組，揭示了質(zhì)粒在抗性基因轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要作用。他們的研究成果以“Mobile antibiotic resistome in wastewater treatment plants revealed by Nanopore metagenomic sequencing”為題于2019年3月21日作為研究論文（Research Article）在國(guó)際微生物學(xué)權(quán)威期刊Microbiome (IF: 11.607) 上在線發(fā)表。

http:///10.1186/s40168-019-0663-0

背景解讀

抗生素抗性基因的廣泛傳播嚴(yán)重影響了人類的身體健康，污水處理廠作為一個(gè)連接人類活動(dòng)和自然生態(tài)系統(tǒng)的重要節(jié)點(diǎn)，具有豐富的微生物遺傳多樣性，加上污水中殘留的抗生素以及其它共選擇篩選壓力，使其對(duì)抗生素抗性基因的水平轉(zhuǎn)移起到了重要作用。目前有多種可移動(dòng)基因元件，包括質(zhì)粒 (Plasmid)、整合性結(jié)合元件 （ICEs）、轉(zhuǎn)座子 (Transposon)、以及整合子 (Integron) 能夠介導(dǎo)抗性基因的轉(zhuǎn)移。為了能夠全面了解污水處理體系中抗生素抗性基因以及多抗耐藥菌株的動(dòng)態(tài)傳播過(guò)程，我們需要解析不同抗生素抗性基因的遺傳背景、宿主信息并且追蹤它們?cè)谡麄€(gè)污水處理體系過(guò)程中的變化。然而不管是基于傳統(tǒng)的耐藥菌株分離培養(yǎng)的方法，還是基于二代測(cè)序組裝、或者epicPCR的方法都不能達(dá)到理想的解析效果。隨著三代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，長(zhǎng)讀長(zhǎng)的特點(diǎn)為我們解析復(fù)雜的遺傳元件提供了可能性。

該研究充分利用了Nanopore測(cè)序長(zhǎng)讀長(zhǎng)以及實(shí)時(shí)測(cè)序的優(yōu)勢(shì)，開發(fā)了一套基于高通量測(cè)序的抗性基因遺傳背景解析、宿主鑒定的分析流程 （圖1）。該論文所構(gòu)建的分析流程不僅使我們對(duì)污水處理體系可移動(dòng)抗性基因組有了全新的認(rèn)識(shí)，同時(shí)為進(jìn)一步解析耐藥菌株的產(chǎn)生以及傳播機(jī)制提供了重要參考。

圖1. 污水處理體系抗性基因遺傳背景解析、宿主鑒定和追蹤分析流程

結(jié)果分析

一、攜帶抗性基因的質(zhì)粒和整合性結(jié)合元件在污水處理體系抗性組中占主導(dǎo)地位

圖2. 抗生素抗性基因遺傳背景解析

基于不同抗性基因的移動(dòng)潛力，該研究將所有檢測(cè)到的抗性基因分為兩大類，第一類：能夠在細(xì)胞間水平轉(zhuǎn)移的可移動(dòng)抗性基因組，這類抗性基因位于能夠介導(dǎo)細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的移動(dòng)元件上，包括質(zhì)粒和整合性結(jié)合元件；第二類為基因組上攜帶的低移動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)抗性基因組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比位于基因組上的抗性基因（29%），大部分抗性基因由質(zhì)粒和整合性結(jié)合元件攜帶（55%），并且在攜帶抗性基因的質(zhì)粒上，其它的移動(dòng)元件，包括轉(zhuǎn)座子和整合子比位于基因組上分布更加廣泛，這些移動(dòng)元件對(duì)于質(zhì)粒上面抗性基因的快速富集和積累至關(guān)重要。值得一提的是，該研究發(fā)現(xiàn)ICEs攜帶了13個(gè)抗性基因亞型， 包括氨基糖苷類（aadE）、β-內(nèi)酰胺類（CfxA、CfxA2和CfxA3）、氯霉素類（catQ）、MLS類（ermB、mefA/E、ermF、ermG和ermC）以及四環(huán)素類（tetQ、tetM和tetO）。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明ICEs對(duì)于抗性基因的傳播或許會(huì)起到重要作用（圖2）。

圖3. 通過(guò)移動(dòng)原件和宿主追蹤識(shí)別廣譜可持續(xù)抗性基因

通過(guò)對(duì)攜帶抗性基因的可移動(dòng)元件和基因組進(jìn)行追蹤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)29個(gè)由質(zhì)粒攜帶抗性基因亞型在至少一個(gè)污水處理廠的進(jìn)水和出水中同時(shí)存在，其中有23個(gè)存在于該研究所分析的三個(gè)污水處理廠中（圖3）。由于這些具有高移動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)的抗性基因在污水處理廠中不能被有效地去除，這可能是導(dǎo)致下游受納水體中抗性基因傳播的重要原因。

二、快速鑒定污水處理體系潛在耐藥致病菌群

圖4. 快速破譯潛在耐藥致病菌群

快速識(shí)別抗生素耐藥治病菌群對(duì)于污水處理中實(shí)現(xiàn)病原體有效控制是十分必要的，Nanopore實(shí)時(shí)測(cè)序的特點(diǎn)使得對(duì)抗生素耐藥治病菌群的快速檢測(cè)和示蹤成為可能。該研究在所有樣本中共檢測(cè)到10種潛在耐藥致病菌，這些細(xì)菌大部分屬于Gammaproteobacteria，包括Aeromonas、Escherichia、Klebsiella、Acinetobacter和Pseudomonas（圖4a），值得注意的是大部分致病菌為多抗耐藥菌株，所攜帶的抗性基因涵蓋了6大抗性類型（圖4b）。通過(guò)追蹤監(jiān)測(cè)這些潛在致病菌群，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)種群，其中三個(gè)屬于ESKAPE類（Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumanni和Pseudomonas aeruginosa）持續(xù)存在于污水處理的各個(gè)階段（圖4c），這些結(jié)果表明，這些多抗耐藥治病菌株很有可能通過(guò)污水處理廠的處理過(guò)程進(jìn)入下游接收環(huán)境，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了有效的污水消毒的重要性。

三、基因型表型關(guān)聯(lián)分析揭示質(zhì)粒對(duì)于多重耐藥菌株的重要貢獻(xiàn)

圖5. 進(jìn)出水多抗耐藥菌株基因型表型關(guān)聯(lián)分析

通過(guò)對(duì)污水處理體系進(jìn)出水中的多抗耐藥菌株進(jìn)行分離培養(yǎng)，結(jié)合Nanopore高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多抗耐藥菌株主要分布于8個(gè)物種（圖5a），其中大部分屬于人類潛在致病菌?？剐曰蜃V與給定篩選抗生素的表型高度相關(guān)，其中氨基糖苷類抗性基因最為豐富，其次是β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素和氯霉素。除此之外，還檢測(cè)到五種與磺胺類、奎諾酮類、甲氧芐啶類，利福霉素類和博來(lái)霉素相關(guān)的抗性基因，說(shuō)明多種抗性基因的共現(xiàn)性普遍存在于該研究所篩選的多抗耐藥菌株中（圖5b）。最為重要的是，除了acrD 和AmpC抗性基因，其它檢測(cè)到的抗性基因由質(zhì)粒攜帶（圖5c）, 其主要質(zhì)粒遺傳圖譜見圖6。

圖6. 質(zhì)粒攜帶的多抗耐藥基因簇

通訊作者簡(jiǎn)介

張彤，香港大學(xué)土木工程系教授，香港大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院榮譽(yù)教授，南方科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院長(zhǎng)期訪問(wèn)杰出教授。長(zhǎng)期從事污水生物處理和環(huán)境工程微生物組的科研工作，研究領(lǐng)域包括生物脫氮除磷，新興污染物的生物降解，污水中抗生素抗性基因及致病菌檢測(cè)等。張彤教授實(shí)驗(yàn)室在環(huán)境分子生物學(xué)技術(shù)和宏基因組學(xué)技術(shù)等方面積累了豐富經(jīng)驗(yàn)。在The ISME Journal，Microbiome，Environmental Science & Technology，Water Research， Bioinformatics等學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表相關(guān)學(xué)術(shù)論文220余篇，其中ESI高被引論文16篇，H指數(shù)69 (谷歌學(xué)術(shù))，總引用15000次（谷歌學(xué)術(shù)），并于2018年獲選科睿唯安（Clarivate Analytics）全球“高被引科學(xué)家”。

Reference

文章主頁(yè)：https://microbiomejournal./articles/10.1186/s40168-019-0663-0

引文：Che Y, Xia Y, Liu L, Li AD, Yang Y, Zhang T. Mobile antibiotic resistome in wastewater treatment plants revealed by Nanopore metagenomic sequencing. Microbiome. 2019. 7(1):44.