Armstrong：雙特異性抗體

昵稱37701268 2020-05-17

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近年來，雙特異性抗體有一個明顯的井噴趨勢，實質(zhì)上是靶點協(xié)同設計伴隨著腫瘤免疫而興起。國內(nèi)的雙特異性抗體更多地是一種Fast Follow的競爭環(huán)境，本文主要梳理雙抗的研發(fā)格局。理解雙抗的邏輯有兩個層面：技術(shù)平臺、靶點組合。其中技術(shù)平臺一度是重要的一環(huán)，然而隨著技術(shù)的進步靶點組合背后的機制探索才是更重要的因素。

技術(shù)平臺

關(guān)于雙抗技術(shù)，已經(jīng)有許多綜述文章進行羅列。最早的雙抗設計思路很直接，因為抗體是二對稱的，將兩個半抗體組合即可形成雙特異性抗體。由此，早期的雙抗設計集中在促進異源重鏈的形成。從理化性質(zhì)上，大概可以歸類為基于空間位阻的KiH等和基于電荷ART-Ig等雙抗技術(shù)平臺。至于輕鏈的匹配問題，可以采用共同輕鏈或者另一層匹配設計。這些工程化的改造構(gòu)成了非對稱雙抗技術(shù)的核心，也是各生物技術(shù)公司專利保護的核心。

基于電荷的設計靈活性更強，因此很多生物技術(shù)公司根據(jù)類似原理開發(fā)了雙特異性抗體技術(shù)。不過考慮到兩條鏈相互作用的氨基酸總歸是比較保守，因此不同技術(shù)平臺在改造專利中氨基酸突變保護的覆蓋范圍上會有一些overlap。

非對稱雙抗的不同設計還有Duobody，通過405、409位氨基酸突變促進Fab exchange形成雙抗，表達時兩個單抗分別表達，體外構(gòu)建雙抗。

另外一個獨特設計的非對稱雙抗包括再生元的雙抗技術(shù)思路稍顯不同，基于改造后的重鏈不再結(jié)合Protein A，從而通過Protein A的pH梯度純化來得到雙抗。

韓美的Pentambody是在CH3引入突變，促進異源二聚體之間形成氫鍵。凡恩世2019年9月與韓美達成合作，開發(fā)雙抗和多抗。

國內(nèi)的雙抗技術(shù)平臺總體上與前述相符，如康寧杰瑞CRIB、愛思邁的Exmab雙抗技術(shù)（下圖）均基于電荷來促進異源二聚體重鏈的形成，與ART-Ig等基于電荷的雙抗技術(shù)類似。

國內(nèi)也誕生了一些獨具特色的雙抗技術(shù)，包括藥明生物的Wuxibody等。藥明生物的Wuxibody是一種對稱的雙抗技術(shù)，形式上市Fab串聯(lián)至第一個抗體的重鏈N端（類似于Crossmab、岸邁生物FIT-Ig等，此類雙抗分子量大，為250kD左右），其技術(shù)核心是通過TCR的恒定區(qū)替換Fab的恒定區(qū)，避免輕鏈的錯配。

藥明生物Wuxibody目前已達成多項授權(quán)合作協(xié)議。

對稱雙抗的工程化改造相對簡單，如中山康方的Tetrabody技術(shù)（下圖為PD-1/CTLA-4雙抗AK104）。其中很多雙抗技術(shù)采用的實際上是類似于基于抗體融合蛋白。即在輕鏈或重鏈的N端或C端融合另一domain，可以是細胞因子、scFv、納米抗體等。這類雙抗在表達和純化上都與單抗完全相同。

很多雙抗實際上應用了類似的設計。如翰思生物的PD-1/CD47雙抗（PD-1抗體與SIRPα融合）、比洋生物PD-1抗體-CD80融合蛋白、信達生物OX40抗體-PD-L1納米抗體融合蛋白、普米斯生物基于納米抗體的PD-L1/TGF-β雙抗等。

如果兩個抗體部分都采用單鏈的納米抗體或scFv，雙抗的形式更為簡單。典型的如安進的BiTE（2個scFv串聯(lián)）、Numab的兔雙抗MATCH技術(shù)、Ablynx的納米雙抗、Harpoon的TriTAC技術(shù)（一個scFv和一個納米抗體串聯(lián)）。在半衰期方面，安進二代BiTE技術(shù)在2個scFv基礎上再串聯(lián)一個Fc且其兩條鏈也采取首尾相連（整體仍是單鏈），Numab串聯(lián)一個抗HSA的兔scFv、Ablynx再串聯(lián)一個抗HSA的納米抗體，Harpoon再串聯(lián)一個抗HSA的納米抗體。其中Numab、Ablynx、Harpoon由于都采用抗白蛋白的單鏈抗體結(jié)構(gòu)域，因此整體分子量都很小且無糖基化，表達上也可以采用微生物表達。如Ablynx采用畢赤酵母表達。

類似的，康寧杰瑞PD-L1/CTLA-4雙抗KN046即抗PD-L1和抗CTLA-4的兩個納米抗體串聯(lián)至Fc。和安進二代BiTE區(qū)別在于Fc為雙鏈，每條重鏈串聯(lián)PD-L1納米抗體和CTLA-4納米抗體，為二對稱四價抗體。

和鉑醫(yī)藥（HCAb）和百奧賽圖（RenNano）的重鏈抗體在結(jié)構(gòu)上類似于納米抗體，構(gòu)建雙抗時與上述結(jié)構(gòu)類似。

洛啟生物開發(fā)的PD-L1/4-1BB納米雙抗與上述結(jié)構(gòu)類似。

傳奇生物等將串聯(lián)的納米抗體用于構(gòu)建雙特異性的CAR-T細胞療法，如傳奇生物構(gòu)建的靶向CD19/CD20的雙特異性CAR-T療法。

除了納米雙抗或者scFv雙抗，一些類抗體也采取類似的架構(gòu)。如前幾天創(chuàng)響生物引進Affibody公司的ABY-035，即為靶向IL-17的二價類抗體。其中ABD為結(jié)合白蛋白的affibody結(jié)構(gòu)域，起到延長半衰期（類似Fc的作用）的效果。Z1、Z2不同時即為雙特異性Affibody，如在開發(fā)的HER2/HER3 雙特異性Affibody。

靶點組合

除了雙抗形式實現(xiàn)依靠的技術(shù)之外，更重要的問題依然是靶點本身的組合問題。以CD3、CD16為基礎的雙抗本質(zhì)上是募集T細胞或NK細胞殺傷靶細胞，由于其中一個靶點已經(jīng)鎖定，因而該類雙抗在機制探索中積累了一些經(jīng)驗。腫瘤免疫的興起則帶動雙抗形成新一輪的井噴趨勢，尤以PD-1或PD-L1為基礎尋找具有協(xié)同效應的雙抗靶點為最。

協(xié)同效應

HER2雙表位的協(xié)同效應已經(jīng)被羅氏Herceptin、Perjeta聯(lián)用所證實，康寧杰瑞、天廣實等開發(fā)了HER2雙表位的雙抗，百濟神州則引進了Zymeworks的HER2雙表位雙抗ZW25和ADC雙抗ZW49。

AMD等眼病繼VEGF之后阻斷多條血管增生通路的多特異性治療（抗體或融合蛋白）成為新的熱點，PDGF靶點失敗之后，羅氏正在開發(fā)VEGF/Ang2雙抗Faricimab（下圖），信達生物開發(fā)VEGF/CFD融合蛋白等。再如自身免疫病中，百時美施貴寶開發(fā)IL-17A/IL-23，禮來開發(fā)IL-17/TNFα雙抗等，設計思路都是希望通過阻斷不同的炎癥通路可以達到協(xié)同效應的目的。

CD3雙抗

不論是PD-1抗體為代表的免疫檢驗點抑制劑、還是CAR-T等，T細胞都是一個治療的核心。但CD3雙抗一個很重要的問題是正常組織過度激活T細胞有很強的毒性，因而CD3雙抗的發(fā)展經(jīng)歷了一些波折。不同的生物技術(shù)公司在CD3抗體的選擇和具體設計上都形成了獨有的技術(shù)平臺，盡量平衡有效性與安全性。如紀念斯隆凱瑟琳中心發(fā)現(xiàn)抗CD3的scFv镕和達輕鏈C端的抗腫瘤活性更強。

安進二代BiTE將Fc兩條鏈首尾相連串聯(lián)到2個scFv上，可以更好的保證CD3抗體依賴于另外一個腫瘤靶點的結(jié)合再激活T細胞。

由于表位、親和力、寡聚化、FcγR依賴的cross-linking等都會影響雙抗的有效性和安全性，上述的規(guī)律并不能簡單推廣于其他CD3雙抗。但這些發(fā)現(xiàn)為后來者提供了一些重要的參考。

另外一種解決思路是引進腫瘤微環(huán)境條件激活的技術(shù)到有類似毒性問題的雙抗中，以更好的平衡安全性與有效性的問題。如安斯泰來引進Cytomx的Probody技術(shù)，開發(fā)CD3雙抗。

中外制藥開發(fā)了高濃度ATP（腫瘤微環(huán)境特異）以來的雙抗技術(shù)，保證在腫瘤微環(huán)境才能特異性結(jié)合抗原。

共刺激雙抗：CD28雙抗和4-1BB雙抗

去年以來，賽諾菲CD38/CD3/CD28三特異性抗體，再生元CD28共刺激雙抗，中外制藥4-1BB共刺激雙抗增強CD3雙抗療效相繼進入視野。這些雙抗或多特性抗體的原理類似于CAR-T，即通過選用低親和力的CD3抗體保證安全性，同時通過CD28抗體或4-1BB抗體增強腫瘤微環(huán)境中腫瘤細胞靶點結(jié)合后T細胞的激活。也就是同時解決安全性和有效性的問題。

PD-L1/4-1BB雙抗也有類似的問題，因為4-1BB抗體本身有毒性問題，因此雙抗設計上強調(diào)PD-L1結(jié)合以來的4-1BB激活。基石藥業(yè)（引進Numab的ND021，如下圖）、科望生物（引進Inhibrx的Inbrx-105）、維立志博、洛啟生物（納米雙抗）等都強調(diào)類似的作用機制。此次AACR披露F-Star的PD-L1/4-1BB雙抗強調(diào)4-1BB的激活依賴于PD-L1介導的cross-linking。當然，艾伯維今年2月Molecular Cancer Therapeutics期刊上發(fā)表的文章，已經(jīng)證實FcγR依賴的Cross-linking和結(jié)合表位是降低4-1BB單抗肝毒性和提高抗腫瘤活性的關(guān)鍵。也就是說通過單抗結(jié)合表位/Cross-linking的優(yōu)化，或者雙抗的第二靶點（PD-L1介導）的設計，都有可能改善4-1BB靶點的安全性并提高抗腫瘤活性。

圍繞NK細胞的三特異性抗體

類似于賽諾菲基于T細胞的TAA/CD28/CD3三特異性抗體，Innate Pharma開發(fā)了基于NK細胞的TAA/CD 16/NKp46三特異性抗體NKCE技術(shù)，以更好的募集和激活NK細胞，殺傷腫瘤細胞。

類似的技術(shù)還有Dragonfly Therapeutics開發(fā)的TriNKET技術(shù)，為TAA/CD16/NKG2D三特異性抗體。也就是說，在TAA/CD16傳統(tǒng)雙抗基礎上，Dragonfly引入了NKG2D、Innate Pharma引入了NKp46來更好的激活NK細胞。Innate Pharma背靠阿斯利康開展多項合作，Dragonfly則背靠新基（如今是百時美施貴寶）開展多項合作。

此外，有國內(nèi)企業(yè)如百利藥業(yè)開發(fā)了四特異性抗體技術(shù)GNC，架構(gòu)為scFv串聯(lián)的TAA/CD3/4-1BB/PD-L1。細節(jié)可見參考文章，此處不做評論。

抗體-細胞因子融合蛋白

PD-1等免疫檢驗點之后，腫瘤免疫目前的競爭焦點在于更好的激活免疫系統(tǒng)，以提高PD-1抗體等的響應率。簡單說，就是多機制變冷腫瘤為熱腫瘤，提高治療效果。

在這之中，細胞因子IL-2、IL-7、IL-10、IL-15、TGF-β等被廣泛嘗試用于提高PD-1抗體等的響應率和療效。除了聯(lián)合治療，抗體-細胞因子融合蛋白成為一種重要的方式。

PD-L1/TGF-β融合蛋白M7824大火之后，恒瑞醫(yī)藥SHR-1701、普米斯生物PM8001、創(chuàng)勝集團等都在跟蹤開發(fā)。除此之外，IL-2、IL-7、IL-15、SIRPα也有國內(nèi)生物技術(shù)公司用于構(gòu)建抗體-細胞因子融合蛋白。

此外，TLR8抑制劑近年來也被初步證實可以提高免疫檢驗點抗體藥物的療效。Silverback即致力于開發(fā)抗體-TLR8抑制劑的ImmunoTAC技術(shù)平臺，由于TLR8抑制劑為小分子，因此整個分子形式上類似于ADC，但作用機制上類似于抗體融合蛋白或雙抗。

小編總結(jié)

雙抗領(lǐng)域誕生了很多技術(shù)平臺，當下已經(jīng)進入了深水區(qū)，靶點組合背后的機制探索成為核心。相對應地，一些靶點組合逐漸殺出重圍，尤其是CD3雙抗日漸成熟。如血液瘤方面，CD3/CD20雙抗對于一些CD19 CAR-T治療抵抗的患者仍有療效，2019年ASH會議上5家藥企的CD3/CD20雙抗披露積極數(shù)據(jù)。多發(fā)性骨髓瘤，BCMA/CD3雙抗也成為研發(fā)熱點。

免疫檢驗點有很大的組合空間，但真正找到有協(xié)同效應的雙抗靶點組合及合理設計并不容易。如中山康方PD-1/CTLA-4聯(lián)合化療胃癌治療取得積極數(shù)據(jù)，但響應率與PD-1抗體聯(lián)合化療似乎差不多（非頭對頭對比）。此次AACR葛蘭素史克OX40抗體聯(lián)合PD-1抗體Keytruda則未表現(xiàn)出協(xié)同作用。

總體來看，國內(nèi)的雙抗研發(fā)涌現(xiàn)一些具有特色的技術(shù)平臺。靶點組合方面的創(chuàng)新則遠遠少于平臺創(chuàng)新，幾乎所有的雙抗項目在靶點方面都跟蹤國外（同樣的靶點組合或有聯(lián)用治療的背景），如PD-L1/TGFβ即至少有3家藥企跟蹤。在小編看來，國內(nèi)的雙抗研發(fā)以fast follow為主，如恒瑞在PD-L1/TGFβ、PD-1與IL-15聯(lián)用等仍然走在最前的位置上。這也符合國內(nèi)生物醫(yī)藥的大環(huán)境，控藥價與可負擔是最重要的。Fast follow是風險小、成本可控的模式，本質(zhì)上仍是商業(yè)邏輯。中國生物醫(yī)藥近十年的變遷，fast follow是第一要義，只不過follow的對象從化學仿制藥到生物類似藥，再到同靶點單抗，再到同組合雙抗。在這種背景下，速度和效率最重要，創(chuàng)新更多體現(xiàn)在差異化以求得細分市場和賣點。