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流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞的分析檢測必須基于單細(xì)胞的基礎(chǔ)上，這是流式細(xì)胞術(shù)的基本要求。因此就必須把實體組織制備成單細(xì)胞懸液。在應(yīng)用FCM技術(shù)中，制備出合格的單分散細(xì)胞是流式細(xì)胞術(shù)樣本制備技術(shù)中重要的一環(huán)。它要求這種分散細(xì)胞方法既要使細(xì)胞成為單個細(xì)胞，又能保持細(xì)胞的固有生物化學(xué)成分及生物學(xué)特性。 流式細(xì)胞術(shù)樣品制備大致可分為下面五個步驟：① 取材：取手術(shù)或活檢組織必須具有代表性，如取手術(shù)腫瘤組織，必須取瘤細(xì)胞生長旺盛部位；組織等標(biāo)本必須在取材后保持樣本的新鮮；一般在室溫1個小時之內(nèi)處理好樣本或及時用固定劑或低溫對組織進(jìn)行保存；② 對細(xì)胞的待測生物化學(xué)成分進(jìn)行熒光染色；③ 按照廠家提供的軟件程序?qū)颖具M(jìn)行獲取、檢測和存儲；④再依照軟件提供的程序?qū)z測結(jié)果進(jìn)行定量分析；⑤ 檢測分析結(jié)果在生物、醫(yī)學(xué)上的意義進(jìn)行分析和評價。 第1節(jié) 樣本單細(xì)胞懸液的制備方法 一 新鮮實體組織樣本的制備 FCM對單細(xì)胞快速進(jìn)行各種參數(shù)分析必須基于單細(xì)胞基礎(chǔ)上，根據(jù)各種組織成分的特點，可選擇不同的分散細(xì)胞方法，以期達(dá)到單細(xì)胞產(chǎn)額高、損傷少的目的。盡管標(biāo)本制備已形成了標(biāo)準(zhǔn)化的程序，但實際操作中總會出現(xiàn)這樣或那樣的問題。在實體組織分散為單個細(xì)胞過程中，解離的方法可能瞬間地或持久地影響細(xì)胞的性質(zhì)、形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能等。所以，在對各種不同組織進(jìn)行分散選擇方法時，應(yīng)盡量減少對細(xì)胞的這種影響。目前常用的分散組織細(xì)胞的方法有如下3種。 （一） 酶消化法 1 作用原理： 對實體組織分散的作用原理主要有3方面：① 可以破壞組織間的膠原纖維、彈性纖維等；②可以水解組織間的粘多糖等物質(zhì)；③可以水解組織細(xì)胞間的緊密聯(lián)結(jié)裝置的蛋白質(zhì)物質(zhì)。酶消化法是實體瘤、培養(yǎng)細(xì)胞分散為單細(xì)胞的主要方法之一。常用的酶類試劑有：蛋白酶類——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解離組織中的細(xì)胞。胰蛋白酶能水解脂鍵和肽鍵；膠原酶能降解幾種分子類型的膠原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷鍵；彈性蛋白酶能消化連接組織的糖蛋白和彈性蛋白的纖維。不同酶對細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間不同組分有特異作用，可根據(jù)分散組織類型來確定使用的酶類。 2 注意事項： ① 酶需要溶解于適當(dāng)?shù)娜芤褐校@些溶液不致于造成酶效價降低；②要注意酶的使用濃度和消化時間；③要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在堿性環(huán)境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶劑中活性不佳等；④ 要隨時注意影響酶活性的其它因素，如酶的生產(chǎn)批號等。 3 方法學(xué)程序 （1） 將適合于酶消化的組織置于離心管中； （2） 將選好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化組織的試管中； （3） 一般消化20-30分鐘（恒溫37℃或室溫），消化期間要間斷振蕩或吹打； （4） 終止消化，收集細(xì)胞懸液，以300目尼龍網(wǎng)過濾，除去細(xì)胞團(tuán)塊，以低速成離心除去細(xì)胞碎片； （5） 將制備好的單細(xì)胞懸液進(jìn)行進(jìn)一步熒光染色后上機(jī)檢測，或保存?zhèn)溆谩?br> （二） 機(jī)械法 機(jī)械法分散實體組織包括：用手術(shù)剪刀剪碎或者用鋒利的解剖刀剁碎組織，用勻漿器勻漿，再用細(xì)注射針頭抽吸細(xì)胞或用300目尼龍網(wǎng)濾出單細(xì)胞懸液；采用搓網(wǎng)法也能獲得大量細(xì)胞。機(jī)械法易造成細(xì)胞碎片和細(xì)胞團(tuán)塊，所以機(jī)械法常與其它方法配合使用。 1 剪碎法： ① 將組織塊放入平皿中，加入少量生理鹽水； ② 用剪刀將組織剪至勻漿狀； ③ 加入10ml生理鹽水； ④ 用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管中； ⑤ 離心沉淀1000prm,3-5min，再用生理鹽水洗3遍，每次以低速（500-800prm）短時離心沉淀去除細(xì)胞碎片； ⑥ 以300目尼龍網(wǎng)濾去細(xì)胞團(tuán)塊； ⑦ 細(xì)胞用固定液固定或低溫保存?zhèn)溆谩?br> 2 網(wǎng)搓法 ① 將100目，300目尼龍網(wǎng)扎在小燒杯上； ② 把剪碎的的組織放在網(wǎng)上，以眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊加生理鹽水沖洗，直到將組織搓完； ③ 收集細(xì)胞懸液，離心沉淀500-800prm，2分鐘； ④ 固定細(xì)胞或低溫保存?zhèn)溆谩?br> 3 研磨法 準(zhǔn)備一只70ml研磨器。 ① 先將組織剪成1-2mm3大小組織塊； ② 放入組織研磨器中加入1-2ml生理鹽水； ③ 轉(zhuǎn)動研棒，研至勻漿； ④ 加入10ml生理鹽水，沖洗研磨器； ⑤ 收集細(xì)胞懸液，并經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀500-800 prm，1-2 min，再以生理鹽水洗3 遍，離心沉淀； ⑥ 固定或低溫保存細(xì)胞懸液，備用。 （三） 化學(xué)處理法 1 作用原理 化學(xué)處理法是將組織細(xì)胞間起粘著作用的鈣鎂離子置換出來，從而使細(xì)胞分散開來。 2 試劑的配制 ① 0.2%EDTA配制：稱EDTA 0.2g，加入Hankˊs液100ml，封裝高壓消毒。置0℃-4℃保存； ② 胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g 加PBS（pH7.0）200ml，濃度0.125%，EDTA 0.2g加PBS（pH7.0）100ml，濃度0.2%。各取40ml混合，分裝置冰箱保存，用時過濾即可使用。 3 實驗方法 ① 將組織切成薄片，置入試管中； ② 首先加入EDTA液5ml，室溫下0.5h，離心棄之； ③ 再加入胰酶-EDTA液5ml。在37℃恒溫水浴振蕩器內(nèi)30min； ④ 用300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀1000prm，5min。再以生理鹽水洗2-3次； ⑤ 細(xì)胞固定或低溫保存?zhèn)溆谩?br> 以上幾種分散細(xì)胞的方法都是目前對實體組織解聚的常用的方法。實驗證明，用化學(xué)試劑方法處理組織導(dǎo)致細(xì)胞成活率低，細(xì)胞產(chǎn)額低，細(xì)胞碎片和細(xì)胞聚集的量不穩(wěn)定；化學(xué)試劑可單獨使用，也可與其它方法結(jié)合使用；機(jī)械法常常造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，單細(xì)胞產(chǎn)量低；酶學(xué)法、化學(xué)法對實體組織的分散解聚較理想，但對所測化學(xué)成分有不良影響。所以要根據(jù)實驗?zāi)康娜ミx擇合適的單細(xì)胞懸液制備方法，才能獲得理想的樣本和更好的FCM檢測結(jié)果。 （四） 注意事項 ① 新鮮組織標(biāo)本應(yīng)及時進(jìn)行處理保存，以免組織在室溫下放置時間過長，產(chǎn)生中心組織壞死以及細(xì)胞自溶，影響FCM測定結(jié)果； ② 根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇最隹的固定方法，以免由于固定劑的原因，造成FCM檢測結(jié)果的不穩(wěn)定； ③ 酶學(xué)法要注意條件的選擇和影響因素，要注意酶的溶劑，消化時間、pH值、濃度等方面對酶消化法的影響。 ④ 需注意不同組織，選擇相應(yīng)的方法；如富于細(xì)胞的組織——淋巴肉瘤、視神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腦瘤、未分化瘤、髓樣癌以及一些軟組織肉瘤等，就不一定采用酶學(xué)法或化學(xué)法；往往用單純的機(jī)械法就可以獲得大量高質(zhì)量的單分散細(xì)胞； ⑤ 在使用酶學(xué)方法時，要重視酶的選用，如含有大量結(jié)締組織的腫瘤——食管癌、乳腺癌、 皮膚癌等，選用膠原酶較好，因為膠原酶具有在Ca++、Mg++存在或在血清狀態(tài)下不發(fā)生活性降低的特性。 二 組織活檢、內(nèi)窺鏡取材標(biāo)本單細(xì)胞懸殊液的制備 正常組織、瘤組織和淋巴結(jié)等活檢組織以及內(nèi)窺鏡（胃鏡、食管鏡等）取材標(biāo)本，由于材料較少，制備起來比較麻煩。但其制備方法與實體組織基本相似。 1 取材后立即放入盛少許PBS液青霉素小瓶中； 2 另取一只小燒杯，杯口用300目尼龍網(wǎng)蓋住并用線繩固定好，并用PBS液濕潤；取新鮮組織標(biāo)本置尼龍網(wǎng)上；因標(biāo)本量較少，尤其是內(nèi)窺鏡取材只少要取3塊以上； 3 在操作前，先將剪刀用PBS液浸潤一下，然后開始剪碎組織； 4 先剪幾下，視基本無組織塊存在時，用原來裝標(biāo)本的青霉素小瓶中的PBS液，沖洗細(xì)胞均漿并過濾于小燒杯中；如果這時仍有可見組織塊，再用剪刀剪碎，再加適量該PBS液沖洗，直至網(wǎng)上無組織塊為止。這樣可盡量多的收集細(xì)胞； 5 細(xì)胞加固定液或低溫保存，備用。 三 石蠟包埋組織樣本的制備 石蠟包埋組織單細(xì)胞分散方法的建立，擴(kuò)大了流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍。對大量臨床隨訪資料通過病理包埋組織的流式細(xì)胞術(shù)分析，可以重新得到深入研究和利用?，F(xiàn)將常用的石蠟包埋組織制備單細(xì)胞方法介紹如下。 1 實驗方法： ① 把石蠟包埋組織切成40-50um厚的組織片3-5片，或用乳缽研成0.5mm直徑大小顆粒 狀，放入10ml的試管中； ② 加入二甲苯5-8ml, 在室溫下脫蠟1-2 天，視石蠟脫凈與否，更換1-2次二甲苯，石蠟脫凈后，棄去二甲苯； ③ 水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步為10 min，去乙醇，加入 蒸餾水3-5 ml，10 min 后棄之； ④消化：加入2 ml 0.5% 胰蛋白酶（pH 1.5-2.0）消化液，置37℃恒溫水浴中消化30 min， 在消化期間，每隔10min 用振蕩器振蕩1次； ⑤ 消化30 min 后，立即加生理鹽水終止消化； ⑥ 經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，未消化好的組織可做第2次消化； ⑦ 收集細(xì)胞懸液，離心沉淀1500 prm ,再以生理鹽水漂洗1-2 次，，離心沉淀500-800prm 去 碎片； ⑧ 保存細(xì)胞備用。 2 注意事項 ① 一定將石蠟從組織中脫干凈，一般脫蠟第1遍應(yīng)在12小時左右，第2遍為30min左右，檢測是否將石蠟已脫凈的方法:是棄去二甲苯，加入無水乙醇如果無絮狀物浮起，即可視為蠟已脫凈，反之則蠟尚未脫凈； ② 消化時間不可過長，以免造成已釋放出的細(xì)胞核被消化； ③ 切片不可過薄或過厚，過薄細(xì)胞碎片過多，影響分析結(jié)果；過厚造成脫蠟不理想。 ④ 消化后的組織應(yīng)先用眼科剪刀剪碎，然后再加胃蛋白酶消化，30min，37℃，然后用 尖吸管吹打成懸液狀； ⑤ 消化后的組織懸液經(jīng)過過濾后可能細(xì)胞數(shù)很少，這樣就要將組織片放在300目尼 龍網(wǎng)上，用底部圓滑的試管磨碎，再用PBS液沖洗一下；如此反復(fù)，就能得到較多的單細(xì)胞懸液。 四 外周血單個核細(xì)胞樣本的制備 血液是天然的單個細(xì)胞分散的細(xì)胞懸液，血細(xì)胞在生理狀態(tài)下呈分散的游離狀態(tài)。它是流式細(xì)胞分析的理想樣品。血液中的主要細(xì)胞成分為白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板；而其中白細(xì)胞主要成分又分為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。但在血細(xì)胞中一般檢測單個核細(xì)胞較為多見。 1 外周血細(xì)胞樣本制備方法的選擇 一般檢測細(xì)胞大分子成分——DNA、RNA、總蛋白質(zhì)、個別基因表達(dá)蛋白等，多采用淋巴細(xì)胞分離液分離法制備單個核細(xì)胞懸液。這樣可以從血液中分離出單個核細(xì)胞——淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、幼稚血細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等。外周血免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、某些基因蛋白、細(xì)胞表面標(biāo)志檢測可采用溶紅細(xì)胞法。 2 單個核細(xì)胞樣品制備程序： ① 取外周血2ml，肝素抗凝，用生理鹽水將血稀釋成4 ml ,混勻； ② 將稀釋后血液沿試管壁徐徐加入4ml淋巴細(xì)胞分離液到液面之上，勿用力過大，以免造成血液與分離液混合，保持清晰的分層狀態(tài)； ③ 離心2000prm,30min,室溫18-20℃，離心后可見試管內(nèi)的血液清楚的分為4 層，上層為血漿層，中層為分離液層（單個核細(xì)胞所處于血漿層和分離液層中間），底層為紅細(xì)胞層，紅細(xì)胞層上為粒細(xì)胞層； ④ 用吸管將上層與中層之間的淋巴細(xì)胞層吸出收集到另1 試管中，用生理鹽水洗2 遍， 每次均以1500 prm ,10 min ,棄上清后即得到高純度的單個核細(xì)胞懸液； ⑤用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汗潭ɑ蛑玫蜏乇浔４娲谩?br> 五 骨髓細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備 1 制備方法 （1） 無菌抽取骨髓液0.5 ml； （2） 將骨髓標(biāo)本滴入1000u/ml肝素抗凝的1 ml PBS液中； （3） 再加入PBS液稀釋至10ml； （4） 用吸管吸取5 ml 稀釋骨髓液徐徐加入盛有4 ml 的人類淋巴細(xì)胞分離液液面之上； （5） 在以上條件下，骨髓有核細(xì)胞分層在PBS-人類淋巴細(xì)胞分離液之間形成的界面上； （6） 吸取有核細(xì)胞層，加入到10 mlPBS液中，混勻； （7） 以1000 prm 離心 5 min ，棄上清；收集骨髓細(xì)胞，加固定液或置低溫冰箱備用。 2 注意事項 （1） 抽骨髓液時，先將注射器針頭、針筒、針?biāo)ㄓ酶嗡亟?，抽取時力量適中； （2） 在吸取淋巴細(xì)胞層時盡量少吸分離液，量應(yīng)掌握在300 ul 左右，這樣有利于洗去多余的分層液； （3） 紅細(xì)胞的方法：以等量的蒸餾水加入到沉淀中，輕輕搖動片刻，見粉紅色出現(xiàn)，立即加入大量生理鹽水，混勻，離心，去除上清即可。 六 培養(yǎng)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液的制備 1 培養(yǎng)細(xì)胞的特征 高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液是FCM分析的保證。一般細(xì)胞培養(yǎng)分為懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)，由于細(xì)胞的增殖，都有可能形成大小不等的細(xì)胞團(tuán)塊或連接成片。如果兩個或多個細(xì)胞粘連在一塊或細(xì)胞碎片過多都將影響FCM結(jié)果，進(jìn)而導(dǎo)致實驗失敗。所以，制備合格的培養(yǎng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液十分重要。 2 培養(yǎng)細(xì)胞樣品的制備程序： （1）將培養(yǎng)細(xì)胞用0.04%乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA2Na）或0.29%胰酶消化3-7min，（根據(jù)室溫情況而定），至光鏡下見到貼壁細(xì)胞間出現(xiàn)篩狀間隙為止），棄去消化液，加PBS液； （2） 用吸管將細(xì)胞從瓶壁上輕輕吹打下來，并移入離心管中； （3） 短時低速離心，即800-1000prm，5 min； （4） 棄上清，加pH7.4的PBS液5-8ml，低速短時離心，800-1000prm，3-5 , min ；重復(fù) 2- 3次，以去除細(xì)胞懸液中的細(xì)胞碎片； （5） 加少許PBS液，將沉淀細(xì)胞輕輕吹打均勻。加固定液或低溫保存待用。 七 脫落細(xì)胞樣品單細(xì)胞懸液的制備 在臨床工作中，可以收集到大量自然脫落細(xì)胞，這些細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)過簡單處理，便可成為較好的單細(xì)胞懸液，提供流式細(xì)胞術(shù)分析。主要包括脫落細(xì)胞、胸腹水細(xì)胞、尿液、內(nèi)鏡刷檢細(xì)胞等。 1 食管拉網(wǎng)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液的制備 (1) 將食管拉網(wǎng)器上的細(xì)胞洗脫到20 ml PBS液中，以1500 prm 離心后，再用PBS液洗2 次，離心500-800 prm, 1-2 min，棄上清； (2) 再加入PBS液5 ml ，以300目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清； (3) 加少許PBS液混勻沉淀細(xì)胞，加固定液或低溫保存，備用。 2 尿液脫落細(xì)胞的單細(xì)胞懸液的制備 （1） 用一清潔器皿收集24小時尿液，置4℃ 冰箱中自然沉淀2小時，輕輕倒去上清液， 留下少許帶細(xì)胞的沉淀物，用吸管移至10-20 ml 離心管中； （2） 500 prm 離心 10min ，去上清； （3） 加PBS液8-10 ml，以1000 prm 離心10 min ，去上清；重復(fù)再洗1 次； （4） 再加5 ml PBS液混勻，用300目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清； （5） 再加少許PBS液，混勻。加固定液或低溫保存，備用。 3 胸、腹水脫落細(xì)胞的制備 （1） 抽取胸、腹水50-100 ml ，加入1000ui/ml肝素液1 ml ，放鹽水瓶中置于4℃冰箱 中靜置6-12小時，棄去上清； （2） 10-20ml ，用長吸管移入試管中，用PBS液洗3 次，以1500 prm 離心沉淀5 min ； （3） 再加5 ml PBS液混勻，用300目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清； （4） 加少許PBS液，混勻；加固定液或低溫保存，備用。 4 沖洗液細(xì)胞樣品的制備 （1）用300-500 ml 生理鹽水沖洗膀胱,沖洗一定時間后,吸出沖洗液放入容器中于冰箱 內(nèi)置6-12小時； （2） 取沉淀液20-40 ml ,離心沉淀并以生理鹽水洗2 次, 吸上清； （3） 加10 mlPBS液，混勻；以300目尼龍濾網(wǎng)過濾，離心沉淀去上清； （4） 過濾后1000prm,10 min，離心沉淀，去上清；加固定液或低溫保存?zhèn)溆谩?br> 七、網(wǎng)織紅細(xì)胞樣品的制備 計數(shù)血液中網(wǎng)織紅細(xì)胞的數(shù)量，對估價骨髓中紅細(xì)胞的生成活性有重要意義。 1 染色原理 網(wǎng)織紅細(xì)胞是一種未完全成熟紅細(xì)胞。在工細(xì)胞成熟過程中，其胞漿中的RNA含量逐漸被血紅蛋白所取代，因此，檢測紅細(xì)胞中RNA的含量多，就代表了紅細(xì)胞的成熟程度。從而成為檢測網(wǎng)織紅細(xì)胞的重要方法。 2 樣品的制備 （1） 抽取全血0.5ml，注入盛有0.5ml的0.1mol/L EDTA溶液中； （2） 用微量取液器及取50μlEDTA抗凝血，置于另一離心管中，加入Good?s緩沖液5.0ml,離沉淀1000prm,5min，連續(xù)洗3次； （3） 將沉淀細(xì)胞加入1.0ml枸椽酸鈉緩沖液，輕輕振蕩懸??； （4） 將懸浮液緩慢注入盛有4ml 0.1%戊二醛緩沖液中固定15min； （5） 上FCM之前，用PBS洗去固定劑，加入0.5ml 0.01%的派若寧工作液；染色30min 離心沉淀去染液，1500prm,5 min； （6） 用PBS洗一次，離心1500prm，5min，去上清，再用PBS將細(xì)胞懸浮，上機(jī)檢測。 八、血小板檢測樣品的制備 循環(huán)性血小板在血管受傷部位迅速形成止血栓子，這些細(xì)胞也參與因血管壁的改變激發(fā)的血栓形成而引起的血流阻塞。另外，血小板還能吸引和結(jié)集白細(xì)胞而參于組織損傷、炎癥反應(yīng)和創(chuàng)傷愈合。血小板膜蛋白（粘附分子）它存在于血小板表面或嵌入α-顆粒中，在正常血小板粘附或凝聚過程式中起關(guān)鍵作用。血小板膜糖蛋白主要包括：富亮氨酸糖蛋白（CD42b/CD42a）、整合素（VLA-2）（CD42b/CD29）、整合素（VLA-5）（CD49e/CD29）、整合素-6（VLA-6）（CD49f/CD29）、血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1（PECAM-1）（CD31）、CD36、整合素（CD41/CD61）和P選擇素（CD62p）。 1 血小板標(biāo)記方法 全血法單標(biāo)測血小板CD62p、CD63、CD42b、CD41、CD61等指標(biāo)。 染色方法步驟： （1） 采血枸櫞酸鹽或EDTA抗凝； （2） 10μl熒光標(biāo)記抗體，加100μl PBS，再加5μl全血（樣品管）； 10μl抗體同型對照，加100μl PBS，再加5μl全血（對照管）； 輕輕混勻，室溫孵育15min； （3） 加2-3ml PBS（1% PFA）終止反應(yīng)，上機(jī)檢測分析。 2 全血法雙標(biāo)記檢測活化血小板（如CD62p-FITC/CD42b-PE） 染色方法步驟： （1） 采血枸櫞酸鹽或水蛭素抗凝； （2）10μl CD62p-FITC加10μl CD42b-PE,再加5μl全血；（樣本管） 10μl IgG1-FITC加10μl IgG1-PE,再加5μl全血；（對照管） 輕輕混勻，室溫孵育15min; （3） 加 2-3 ml PBS（1.0 PFA）終止反應(yīng)，上機(jī)以SS-LOG/CD42b-PE圈定血小板檢測分析。 3 流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板方法學(xué)的注意事項 （1） 抗體的選擇：選擇CD workshop 中的單克隆抗體。因為單克隆抗體反應(yīng)特異性高，非特異性結(jié)合少。但由于血小板富含F(xiàn)c RⅡ(CD32,FcⅡ受體)，而Fc受體對不同抗體亞類具有不同親合力，所以在亞類選擇上，對于人的抗體以選擇IgG1為好。 （2） 抗凝劑的選擇：肝素盡量避免用；EDTA在室溫20-25℃時其抗凝效果與枸椽酸鹽無差別，但在37℃時，EDTA就會影響蛋白結(jié)構(gòu)及剌激血小板活化。 （3） 標(biāo)本的采集：一般采少量外周血，收集在玻璃容器或塑料容光煥發(fā)器中，采血中避免組織液流入血液中；防止氣泡產(chǎn)生；并使用大號針頭（如18號）。盡量減少化學(xué)、物理的激活因素對血小板的活化作用。標(biāo)本的放置溫度以15-25℃為宜，4-10℃以下血小板的外形發(fā)生改變。 （4） 抗體標(biāo)記物的選擇：我們知道，F(xiàn)ITC和PE標(biāo)記是最常用的在488nm激發(fā)下作為雙標(biāo)記使用的試劑，PE的熒光強(qiáng)度比FITC強(qiáng)。因為在用單色測定中CD62p和CD63在靜止血小板上均為弱表達(dá)，檢測這兩個抗原時用PE標(biāo)記為宜。而當(dāng)CD62P和CD63配合一個高強(qiáng)度表達(dá)的抗原CD41、CD61 或CD42b作為雙標(biāo)記時，CD62p和CD63卻宜使用FITC標(biāo)記。 （5） 樣品固定：先固定樣品可減少血小板的體外活化，但先固定可能破壞一些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，增加非特異染色；因此，除作體外剌激血小板活化研究和不能及時處理標(biāo)本外，均應(yīng)先標(biāo)記后固定。固定劑使用0.5-1.0%的多聚甲醛。 （6） 緩沖液：PBS（0.01M,pH7.2）+BSA在孵育和洗滌過程中為首選。但當(dāng)在分析血小板活化過程中洗滌時，宜用Tyrodes緩沖液，因為該緩沖液中含有Mg++和葡萄糖，可能減少血小板的體外活化。 （7） 儀器的設(shè)置：首先利用微球進(jìn)行儀器光路和光電信號的控制，使儀器保持一個穩(wěn)定、靈敏的狀態(tài)。數(shù)據(jù)采集后，散射光和熒光均使用對數(shù)放大，調(diào)節(jié)散射光電壓，使細(xì)胞群分布在中央。調(diào)節(jié)熒光電壓，使樣品繼發(fā)熒光強(qiáng)度落在對數(shù)值1內(nèi)，熒光補(bǔ)嘗可用熒光微球或用雙色標(biāo)記單抗做（如CD4-FITC/CD8-PE）。標(biāo)本至少分析5000個細(xì)胞，而且最大流速不宜超過1000-1500個細(xì)胞/s。 （8） 數(shù)據(jù)分析：在活化血小板（CD62p、CD63）等少量表達(dá)抗原的檢測中，閾值的設(shè)定 一般是使非特異性染色的比例控制在1-2%的范圍內(nèi)，但要對非特異性染色進(jìn)行正確的設(shè)定依靠儀器的敏感度及試劑的質(zhì)量。當(dāng)測定的抗原本身為高表達(dá)時，要判斷抗原表達(dá)的高低度時，需要依據(jù)平均熒光強(qiáng)度為宜。 |
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