微量紫外分光光度法

檢測(cè)原理

微量紫外分光光度法檢測(cè)的是核酸的純度和含量，DNA和RNA在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。因此，可以用260nm波長的吸光度測(cè)定DNA或RNA濃度，其吸收強(qiáng)度與DNA和RNA的濃度成正比。

對(duì)于一個(gè)核酸樣品，建議先電泳檢測(cè)，再用紫外分光光度儀檢測(cè)，電泳可以判斷樣品是否提取成功，以確認(rèn)是否還需進(jìn)行純度和濃度測(cè)定。

核酸濃度計(jì)算

針對(duì)不同類型的核酸，其濃度的計(jì)算方法也并不相同：

• dSDNA = 50 × (A260-A310) × 稀釋倍數(shù) (ng/μL)

• ssDNA = 33 × (A260-A310) × 稀釋倍數(shù) (ng/μL)

• RNA = 40 × (A260-A310) × 稀釋倍數(shù) (ng/μL)

檢測(cè)過程

以IMPLEN生產(chǎn)的新產(chǎn)品NanoPhotometer N60為例介紹測(cè)定核酸濃度的具體過程。

選擇檢測(cè)模式

開機(jī)后，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)進(jìn)入上述界面，點(diǎn)擊核酸濃度測(cè)定，進(jìn)入核酸濃度測(cè)定界面。

進(jìn)入核酸濃度測(cè)定界面后，點(diǎn)擊左側(cè)欄中的dsDNA，在右側(cè)欄中選擇待測(cè)樣品的類型，之后點(diǎn)擊最左側(cè)的第一個(gè)圖標(biāo)進(jìn)入樣品測(cè)定界面。

校準(zhǔn)和上樣

首先在上樣孔處點(diǎn)入1.5μL無菌水，注意點(diǎn)樣時(shí)不要有氣泡殘留，扣上樣品蓋之后，點(diǎn)擊頁面中的空白，對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。

校準(zhǔn)完成之后，應(yīng)用擦鏡紙將無菌水擦干凈，之后點(diǎn)入1.5μL待測(cè)樣品，扣上樣品蓋之后，點(diǎn)擊頁面中的樣品，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行核酸濃度和純度的測(cè)定。

結(jié)果獲得

上圖為最后測(cè)得的結(jié)果，左側(cè)的曲線為核酸在不同波長下的吸光度，純的核酸的吸光值，在A230是谷底，在A260是峰頂，在A280則正好是半山坡。

右側(cè)欄為核酸的濃度和純度信息，當(dāng)核酸純度與理想值之間有差別時(shí)，儀器會(huì)自動(dòng)表示為黃色感嘆號(hào)，點(diǎn)擊該處，即可給出可能的原因。

核酸純度評(píng)估

雙鏈DNA純品的A260/A280為1.8，RNA純品的A260/A280為2.0，故根據(jù)A260/A280的值可以估計(jì)DNA的純度。

合格的雙鏈DNA的A260/A280應(yīng)在1.7～1.9之間，若比值較高說明提取的DNA中有RNA殘留，若比值較低說明有蛋白質(zhì)殘留。

合格的RNA的A260/A280應(yīng)為1.9-2.1之間，如果小于1.8，則表明提取的RNA中蛋白質(zhì)雜質(zhì)較多，如大于2.2，則表明RNA發(fā)生了降解。