多聚組氨酸標簽(His-tag)介紹及親和層析原理

相關資料：His標簽親和純化實驗步驟（詳細）

本文描述了多聚組氨酸標簽（His-Tag）融合蛋白使用Ni-IDA/Ni-NTA進行親和層析的基本原理，優(yōu)勢，以及實驗操作流程。

固定化金屬離子親合層析(Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC)，簡稱金屬螯合親合層析，是一種新型的應用于原核蛋白純化的技術。該方法通過蛋白質表面的一些特殊的氨基酸，使之與金屬離子發(fā)生相互作用，從而對蛋白質進行親和純化。這些作用包括配價鍵結合、靜電吸附、共價鍵結合等，其中以6個組氨酸殘基組合的融合標簽（His-Tag）在原核蛋白表達中的應用最為顯著。

His-Tag可結合在目的蛋白的C末端或N末端，形成特殊的結構，以便于進行下一步的純化及檢測。由于金屬螯合親合層析具有配體簡單、吸附量大、分離條件溫和、通用性強等特點，所以可選擇范圍廣，高鹽，存在變性劑以及去垢劑的上樣條件下進行純化，His-Tag正逐漸成為分離純化蛋白質等生物工程產品最有效的技術之一。

His-tag作為蛋白純化時的首選標簽，其優(yōu)勢在于：

1. N-端的His-Tag與細菌的轉錄翻譯機制兼容，有利于蛋白表達；
2. 采用IMAC（固定化金屬離子親合層析）純化His-Tag融合蛋白操作更加簡便；
3. His-Tag對目的蛋白本身特性幾乎沒有影響，不會改變目的蛋白本身的可溶性和生物學功能；
4. His-Tag非常小，在融合蛋白結晶后對蛋白的結構沒有影響；His-Tag的免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射入動物體內進行免疫并制備抗體；
5. 與其它親和標簽構建成雙親和標簽，并可應用于多種表達系統(tǒng)；

His-Tag融合蛋白的適用范圍也較廣，既可以在非離子型表面活性劑存在的條件下純化，也可以在變性條件下進行純化。前者通常用來純化疏水性強的目的蛋白，而后者則通常純化包涵體蛋白。

His-Tag親和層析填料

His-Tag可與多種金屬離子發(fā)生特殊的相互作用，如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，Fe3+等，其原理是利用蛋白質表面的特性，使之被吸附在凝膠柱上，從而達到分離純化蛋白的目的。

Ni2+在親和純化實驗中的使用最為廣泛。根據結合基團的不同，Ni2+親和層析柱可分為倆類——Ni-IDA和Ni-NTA。Ni2+有六個螯合價位，其中Ni-IDA螯合了三價，Ni-NTA螯合了四價。所以IDA的載量要比NTA的高，在同樣條件下Ni-IDA洗脫時的咪唑濃度也高于Ni-NTA。但其弱的結合力使金屬離子在洗脫階段時很容易浸出，與目的蛋白緊密結合，從而導致分離蛋白產量偏低，產品不純及金屬離子污染等問題。而NTA的顆粒粒度均勻，粒徑更小，并且螯合鎳更穩(wěn)定，能耐受較高的還原劑，使填料更加穩(wěn)定，鎳離子不易脫落。

IMAC在通常的情況下是比較穩(wěn)定的，但螯合劑的存在則會導致其金屬離子脫落。例如在E.coli的裂解液中普遍存在一些非特異的弱螯合劑，如在三羧酸循環(huán)中產生了二羧酸類物質。因此，E.coli在某些高壓情況下就會產生高特異性的金屬螯合劑（通常存在于細菌的細胞周質中），導致His-Tag融合蛋白純化的純度和產量大大降低。所以在進行純化His-Tag融合蛋白的實驗時，首先需要去除螯合劑。

Ni-NTA親和層析實驗

Ni-NTA分離帶His標簽的重組蛋白

1. Ni-NTA裝柱，1.6×20cm，柱床體積為10ml；
2. 用緩沖液1平衡2~5個床體積，流速為2ml/min；
3. 將20ml細胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45um濾膜過濾，上樣，流速為1ml/min；
4. 用緩沖液1再洗2~5個床體積，流速為2ml/min；
5. 用分別含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的緩沖液3進行階段洗脫，流速為2ml/min，收集各階段洗脫峰，用SDS-PAGE檢測融合蛋白的分子量大小和純度；
6. 用純水流洗5個柱床體積，再用20%的乙醇流洗3個柱床體積，流速為2ml/min，柱子置于低溫環(huán)境中保存。

緩沖液組成：

緩沖液1

50mM pH7.4的PBS緩沖液。配制：0.5M NaH₂PO₄ 19ml，0.5M Na₂HPO₄ 81ml，NaCl 29.3g，
加適量水溶解后定容到1000ml。

緩沖液2

50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g和咪唑34g, 加適量，水調pH后定容到1000ml。

緩沖液3

不同咪唑濃度的緩沖液B配制：

咪唑洗脫原理

Ni柱中的氯化鎳可以與有His-Tag的融合蛋白結合，也可以與咪唑進行結合，當標簽蛋白與層析柱表面珠孔內的
鎳離子介質發(fā)生結合時，不同濃度的咪唑通過層析柱，就會將與鎳配位的標簽蛋白，雜蛋白等分別洗脫下來，從而得到高純度目標蛋白。

附錄：Ni-IDA和Ni-NTA的一些參數對比