也談新型冠狀病毒核酸檢測 “假陰性”

hghhphf 2020-02-13

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新型冠狀病毒也稱嚴重急性呼吸綜合征（SARS）冠狀病毒-2，與2003年的SARS冠狀病毒一樣，由RNA核酸和蛋白等組成，RNA很容易降解，蛋白衣殼將RNA包裹在其中，加上一層由脂質(zhì)和糖蛋白組成的包膜外衣，從而使其RNA得到保護。病毒通過特定細胞表面的受體入侵細胞造成感染，并且利用宿主細胞進行復(fù)制增殖。因此可以通過采集人的特定部位細胞樣本，檢測其中是否含有病毒RNA核酸，來確認機體是否受到感染。

核酸是由四種不同堿基排列而成，不同病毒的核酸堿基排列方式，就像發(fā)報的密電碼，各有不同。檢測RNA病毒核酸的最為常用的方法是實時熒光RT-PCR。病毒核酸測序則主要用于病毒序列分析、進化及變異研究。核酸檢測就像分析密電碼，新型冠狀病毒也有其特異的密電碼，但是總體與SARS冠狀病毒相似度較高，達80%多，與其它冠狀病毒也具有一定的相似性，與蝙蝠冠狀病毒的核酸序列一致性最高，達95%以上。新型冠狀病毒約3萬個堿基，不同區(qū)域和其它冠狀病毒的相似性有所不同，有些區(qū)域相似度高達90%以上，因此核酸檢測試劑往往選擇相似度低的區(qū)域進行，這樣就可以特異地識別新型冠狀病毒。區(qū)域的識別，通過引物和探針的結(jié)合來實現(xiàn)，因此試劑中的探針和相應(yīng)區(qū)域的高度匹配決定了病毒核酸檢測具有很好的特異性，一旦檢測到，即為“陽性”，證明有病毒的存在。通常我們說病毒核酸檢測是確診感染的“金標準”，這個“金標準”就是指“陽性”結(jié)果。至于假陽性，則通常是由于實驗室人員操作時，發(fā)生了標本間交叉污染或?qū)嶒炇覕U增產(chǎn)物的遺留污染所致，在目前嚴格執(zhí)行“三個陰性樣本隨機放在臨床樣本中間同時參與檢測全過程”的質(zhì)控策略下，可有效避免假陽性結(jié)果的報出，這也是“陽性”結(jié)果可以確診的依據(jù)之所在。但另一方面，如果檢測結(jié)果為“陰性”，則不能作為判斷患者未被感染的“金標準”，原因如下。

在被感染者中檢出核酸，需同時滿足以下四個條件，即（1）被感染者的細胞中有一定量的病毒；（2）采集標本時，必須采集到含有病毒的細胞；（3）可靠的體外診斷試劑；（4）規(guī)范的臨床核酸檢測實驗室（合理的分區(qū)、有能力的檢測人員和嚴格的質(zhì)量管理體系）。

目前網(wǎng)絡(luò)上激烈討論的臨床醫(yī)生反映強烈的核酸檢測“假陰性”概念，往往指的是臨床癥狀及影像學(xué)高度疑似病毒性肺炎，但新型冠狀病毒核酸檢測多次或始終為“陰性”。但對于核酸檢測試劑和臨床實驗室而言，核酸檢測“假陰性”概念則有所不同，前者指的是所采集樣本中存在有足夠量的病毒，但卻沒有被檢出，而不是上述臨床醫(yī)生所稱的核酸檢測結(jié)果與臨床表現(xiàn)不符的“假陰性”。

要想盡可能避免“假陰性”，首先要解決的是“被感染者的細胞中有一定量的病毒、采集標本時采集到含有病毒的細胞”這兩個環(huán)節(jié)的問題。

（1）被感染者的細胞中有一定量的病毒：機體被病毒感染后，病毒通過鼻腔和口腔進入到咽喉部，再到氣管和支氣管，進而到達肺泡，感染者會經(jīng)歷潛伏期、輕度癥狀、再到嚴重癥狀的過程，不同病程階段以及機體不同部位存在的病毒量有所不同，是因為這些部位細胞所含病毒受體占比不同所致。新型冠狀病毒感染，肺泡上皮細胞的病毒受體表達占比最高，氣道上皮細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞等則占比極低。因此，下呼吸道的病毒量明顯高于上呼吸道。呼吸道病毒檢出可能性又高于血液。此外，在疾病發(fā)展過程中，糞便也有較大可能出現(xiàn)病毒，因為研究發(fā)現(xiàn)消化道細胞也表達有病毒受體，一些患者有腹瀉癥狀，不排除糞-口傳播途徑。總之，肺泡灌洗液中最容易檢出病毒核酸，其次是深咳痰，再是鼻咽部，再次是口咽部。因為操作的方便性和患者的接受程度，目前臨床最常用的標本是口咽部拭子，其次是鼻咽部拭子，而在某些患者中，口咽部或鼻咽部細胞中病毒量較少或極低，如果只取口咽部或鼻咽部標本檢測，病毒核酸就檢測不到。盡管肺泡灌洗液更容易檢出核酸，由于其操作的復(fù)雜性，難以作為常規(guī)采樣方法。此外，新冠肺炎患者通常為干咳，痰標本也較難得到。因此，一個特定的疑似感染的患者，不同的病期，在不同的身體部位出現(xiàn)病毒的濃度會有差異，如咽部沒有，卻可能糞便中有，如能同時或在疾病過程中的不同時間采取上述多種標本進行檢測，會有助于“假陰性”的避免。

（2）標本采集時要采集到含有病毒的細胞：理論上說，目前的注冊試劑都包含檢測人細胞的序列“內(nèi)標”，如含有一個單鏈RNA分子的RNase P?！皟?nèi)標”可以監(jiān)測是否采集到足夠量的細胞。但是，采集部位不當，如采集口咽拭子時，采集深度不夠；采集鼻咽拭子沒有采到鼻腔深處等，可能采集到的細胞絕大部分都是不含病毒的細胞，即可能造成“假陰性”。通過加強對標本采集人員的培訓(xùn)，可以在很大程度上解決該問題。

（3）可靠的體外診斷試劑：體外診斷試劑的可靠性非常重要，如前所述，擬檢測的病毒核酸區(qū)域的選擇極為關(guān)鍵。為了提高檢測的敏感性，多數(shù)廠家選擇病毒核酸序列的兩個或兩個以上的區(qū)域進行檢測，在前期調(diào)研中，也發(fā)現(xiàn)實際檢測中，存在一定比例單個靶區(qū)域陽性的結(jié)果，說明試劑對不同區(qū)域的敏感性確實存在差異，也可能是雙靶標或三靶標之間的相互競爭作用所致。此外，試劑反應(yīng)條件、反應(yīng)體系、核酸加入量等都是可能影響檢測分析敏感性的因素。部分廠家的試劑產(chǎn)品由于試劑廠家研發(fā)時間短，也沒有使用已知臨床樣本進行必要的性能確認，可能存在對試劑優(yōu)化不充分以及試劑批間差異大等問題。通過從國家層面開展試劑的檢測性能評價研究，探討存在的問題，可以進一步改進試劑質(zhì)量，提高分析敏感性。此外，臨床實驗室可對每批試劑采用保存的已知幾份陰性和陽性樣本進行使用前的質(zhì)檢，也是一種有效的措施。但試劑的分析敏感性是有極限的，其通常是在采集的樣本中取一部分進行核酸提取，提取后再取一部分進行檢測。因此，在樣本中尋找病毒，就像在一本百萬字的書里尋找錯別字，理論上說，即使只有一個錯別字也可以被發(fā)現(xiàn)；但實際上，由于成本和時間等的限制，只能從中隨機抽取10萬或者20萬字進行查找，如果錯別字數(shù)較少，就有可能不在被抽取的字數(shù)當中，因此無法找到。同樣的，樣本中病毒數(shù)量低于一定程度，試劑也就無法檢出。因此，從這個層面上看，病毒核酸檢測的“假陰性”是無法完全避免的。

（4）規(guī)范的臨床實驗室：標本運輸保存條件、臨床實驗室的規(guī)范操作、結(jié)果判讀和質(zhì)量控制等也是保證檢測結(jié)果準確可靠的關(guān)鍵因素。通過加強對實驗室人員的培訓(xùn)，不斷完善實驗室質(zhì)量管理體系，可以減少因?qū)嶒炇覚z測操作層面出現(xiàn)的“假陰性”。

綜上所述，已被感染的患者有些不能檢出病毒核酸，與臨床表現(xiàn)不符，這種“假陰性”無法完全避免，但是不是就一點別的辦法都沒有了呢？不是的。目前一個行之有效的辦法，就是補充新型冠狀病毒特異抗體檢測。抗體是機體感染病毒后，體液免疫應(yīng)答的產(chǎn)物。通常，IgM抗體在感染早期出現(xiàn)，IgG抗體在感染中晚期出現(xiàn)，滴度有一個持續(xù)增高的過程，并在血液循環(huán)中保持較長時間存在。簡言之，檢測特異抗體也可以明確患者是否“近期或既往感染過新型冠狀病毒”，有助于核酸檢測陰性但臨床上疑似患者的確診?？贵w檢測對臨床實驗室的操作要求相對于核酸檢測要低，可以快速、大量檢測，且可以在基層實驗室完成。但要說明的是，特異抗體檢測陽性不能像病毒核酸檢測陽性一樣作為病毒感染的“金標準”，因為抗體檢測容易受到血液標本中的一些干擾物質(zhì)（如類風(fēng)濕因子、非特異IgM、溶血所致的高濃度血紅蛋白等）的存在而出現(xiàn)“假陽性”結(jié)果，所以抗體檢測必須采用IgM和IgG同時檢測且通常需多次動態(tài)檢測來確認，IgM/IgG初次檢測可能出現(xiàn)的結(jié)果有IgM(+)/IgG(-)、IgM（+）/IgG(+)、IgM(-)/IgG(+)和IgM(-)/IgG(-)四種模式，可按圖1所示流程進行檢測以判斷患者是否為急性或近期感染。