最近發(fā)現(xiàn)由?；?輔酶A（Acyl-CoA）介導(dǎo)的酰化反應(yīng)（見圖1）可能是表觀遺傳過程中的一種新調(diào)節(jié)機制。另外，?；磻?yīng)也與細胞代謝和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程密切相關(guān)。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究證明蛋白質(zhì)上的賴氨酸殘基會發(fā)生?；磻?yīng)，得到系列蛋白賴氨酸酰化產(chǎn)物。這類?；磻?yīng)是近些年新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型，而針對蛋白?；磻?yīng)，現(xiàn)有的分析方法如蛋白免疫印跡法(Western blotting)和蛋白質(zhì)組學(xué)等尚未能同時分析多種蛋白?；a(chǎn)物，無法進行絕對定量分析。該研究中，作者通過組合酶水解法將蛋白水解為單個氨基酸殘基，接下來建立HPLC-MS/MS方法同時鑒定和定量了小鼠肝臟、腎臟、心臟和腦組織中14種蛋白質(zhì)酰化酶解產(chǎn)物，檢測水平在nmol/L水平，其中還包括了4種新鑒定的酰化賴氨酸結(jié)構(gòu)（乙酰乙?；愇祯；?、2-甲基丁酰化和甲基巴豆?；龋?。

圖1 酰基-輔酶A介導(dǎo)的蛋白?；磻?yīng)原理

    作者首先收集3至4個月大的C57BL/6J小鼠的肝臟、腎臟、心臟和腦組織并在液氮中速凍，再將冷凍器官轉(zhuǎn)移至蛋白裂解專用EP管中，加入含蛋白酶抑制劑（無EDTA）的PBS溶液進行樣品勻漿。離心后將上清液轉(zhuǎn)移至EP管中，加入裂解緩沖液（含4％SDS、100 mM HEPES和20 mM DTT，pH 8.0），使用超聲波破碎儀對樣品進行高功率超聲10個循環(huán)，快速離心樣品，將樣品離心后的上清液轉(zhuǎn)移至EP管中，在-20℃下加入4倍體積的冰丙酮過夜沉淀蛋白，4°C下離心30 min，然后將沉淀用4°C的80％丙酮水溶液（v/v）洗滌兩次，氮氣吹干，沉淀樣品使用PBS溶液進行樣品復(fù)溶。

    接下來，作者將上述復(fù)溶樣品分別進行酶水解和酸水解處理，首先使用組合酶切法對復(fù)溶樣品進行酶切，加入0.3單位的鏈霉蛋白酶E（ProE）孵育48 h，ProE中包含來源于灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus）的肽鏈內(nèi)切酶（endopeptidases）和外切酶（exopeptidases），其中肽鏈內(nèi)切酶可以使蛋白結(jié)構(gòu)更適于外切酶的酶切作用，外切酶將蛋白酶切為多肽片段。接下來加入0.1單位的羧肽酶（carboxypeptidase Y）和0.5單位的氨基肽酶（aminopeptidase）孵育24 h，即可進一步將多肽片段酶解為單個氨基酸殘基；酸水解采用強酸（鹽酸）進行水解，可保證蛋白完全水解為氨基酸。將酸水解效率規(guī)定為100%，用水解產(chǎn)物中亮氨酸的量來表示酶水解的效率。采用亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，通過茚三酮反應(yīng)，用分光光度計在546nm波長下測定各組織酶水解和酸水解樣本的吸光度，帶入亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣本中的亮氨酸濃度，以酶水解和酸水解測定的亮氨酸濃度比計算得到各組織樣本的酶水解效率。肝、腎、心臟和腦組織的氨基酸平均酶切效率分別為86%、85%、88%和88%等。

    基于質(zhì)譜裂解規(guī)律和標(biāo)準(zhǔn)品對?；被徇M行鑒定，最終鑒定得到14種?；嚢彼幔瑘D2為2-甲基丁酰賴氨酸的二級質(zhì)譜信息。進一步建立HPLC–MS/MS方法對酶水解樣品進行分析，質(zhì)譜系統(tǒng)為AB公司的API4000液質(zhì)聯(lián)用儀，色譜柱為Waters XSelect HSS T3（250×3.0mm，5μm）色譜柱，流速0.7mL/min，柱溫為25℃。流動相：A=水，B=70%甲醇水溶液（v/v），均添加了七氟丁酸作為流動相添加劑，梯度洗脫。采用多反應(yīng)監(jiān)測模式測定，質(zhì)譜的優(yōu)化參數(shù)見表1，分析物的EIC提取色譜圖見圖3，小鼠各組織器官勻漿液中的?；嚢彼岷恳姳?.

圖2 2-甲基丁酰賴氨酸的二級質(zhì)譜信息

A：標(biāo)準(zhǔn)品：B，肝組織勻漿酶解樣品

表1 14種?；被針?biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜參數(shù)

圖3 14種?；被岬腅IC提取色譜圖

表2 小鼠各組織勻漿液中的?；嚢彼岷?/strong>

    該研究未在蛋白水平研究活性?；?輔酶A介導(dǎo)的蛋白酰基化后修飾，而是對水解得到的酰化賴氨酸進行了表征，作者開發(fā)了用于分析生物樣品中酰化賴氨酸的HPLC-MS/MS分析方法，總共在小鼠肝、腎、心臟和腦組織中勻漿中鑒定和定量了14種?；嚢彼?，其中包括了4種新鑒定的?；嚢彼峤Y(jié)構(gòu)（乙酰乙酰化、異戊?；?、2-甲基丁?；图谆投辊；龋?，為研究蛋白?；笮揎椃磻?yīng)提供一定基礎(chǔ)。

參考文獻

Tim Baldensperger, Simone Di Sanzo , Alessandro Ori, Marcus A. Glomb*. Quantitation of Reactive Acyl-CoA Species Mediated Protein Acylation by HPLC–MS/MS, Anal Chem. 2019, 91, 19, 12336-12343.

文獻整理：李元元；編輯：生寧、張金蘭；第155期