一頓操作猛如虎，一看戰(zhàn)績0-5。

盡管引物設(shè)計(jì)是PCR實(shí)驗(yàn)成功的前提，但是蠻多小伙伴的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)稍顯不足。

今兒就向大家介紹2種引物設(shè)計(jì)方法。

This    is    the    dividing    line.

引 物 設(shè) 計(jì)

盡管是老生常談了，但是小編還是想先把引物設(shè)計(jì)的原則放出來(其實(shí)是復(fù)制粘貼啦，哪哪都有)。

1、引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)設(shè)計(jì)并具有特異性。最好位于編碼區(qū)5\'端的300-400bp區(qū)域內(nèi)，可以用DNAMAN，Alignment軟件看看結(jié)果。

2、不能形成2級結(jié)構(gòu)。

3、引物長度一般在17-25bp之間，上下游引物不能相差太大。

4、G+C含量在40-60%之間，45-55%最佳。

5、堿基要隨機(jī)分布，盡量均勻。

6、引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。

7、引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。

8、引物5‘端可以修飾。

9、3’端不可修飾，而且要避開AT，GC富集的區(qū)域，避開T/C,A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)（2-3個）。

10、引物3\'端要避開密碼子的第三位。

11、引物整體設(shè)計(jì)自由能分布5\'端大于3‘端。

12、定量產(chǎn)物長度80-150bp最好，最長是300bp。

原則忒多啦，小伙伴們，先別暈，看下方。

方法一：PrimerBank法

網(wǎng)址：

https://pga.mgh./primerbank/index.html

打開以上網(wǎng)址，進(jìn)入PrimerBank網(wǎng)站界面，如下圖

個人覺得這是最便捷的引物獲取方法，該網(wǎng)站可以非常迅速地檢索到已經(jīng)他人驗(yàn)證的引物序列及相關(guān)反應(yīng)條件。

圖中第一個方框，一般選擇NCBI Gene ID；第二個方框選擇你所關(guān)注的物種，常用的就是Mouse和Human了，如果為其它物種，則選擇All Species即可；第三個方框中需要輸入你關(guān)注的基因ID號碼。

如何獲取基因ID呢，這里就需要打開NCBI網(wǎng)站，選擇Gene，并輸入你的目的基因如p53 homo，選擇第一個，可見其ID號為7157。如下圖所示。

然后將ID號7157輸入上方PrimerBank網(wǎng)站的For text框中，并選擇種屬為人，點(diǎn)擊Submit后，跳轉(zhuǎn)頁面如下。

網(wǎng)站會自動推薦3對已經(jīng)驗(yàn)證的引物，小伙伴們可以直接拿著用了。

方法二：Ensembl+NCBI BLAST法

很多人會推薦大家使用Oligo、PP或DNA man之類的，小編這里想推薦一個更好用的網(wǎng)站，Ensembl，非常實(shí)用。

網(wǎng)址1：

http://asia./index.html

網(wǎng)址2：

https://www.ncbi.nlm./tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome

首先打開Ensembl網(wǎng)站，選擇物種為Human，檢索基因?yàn)锽RCA2（其它物種可在左下方箭頭處尋找）。如下圖所示。

順手點(diǎn)擊Go，跳轉(zhuǎn)至以下界面。由于我們要拿到轉(zhuǎn)錄組的序列，所以需要進(jìn)一步點(diǎn)擊左側(cè)的Transcript篩選框。

點(diǎn)擊轉(zhuǎn)錄組篩選框后，可見以下界面，我們可以選擇第一個。

繼續(xù)點(diǎn)進(jìn)去，然后在左側(cè)選擇cDNA，點(diǎn)擊后如下圖所示。