實戰(zhàn)：不一樣的CRISPR/CAS9靶點活性驗證！

永隆統(tǒng) 2019-11-20

展開全文

引言

繼慢病毒、溶瘤病毒兩個系列專題后，從本期開始以“CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)”為系列專題，分別從CRISPR/CAS9靶點活性檢測方法、CRISPR/CAS9-sgRNA文庫的設計和運用以及CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)研究進展三個方面展開。

—

摘要

“CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)，已經(jīng)作為一個常態(tài)化的實驗技術(shù)運用于我們的平常實驗中了，其中靶點的有效性驗證至關(guān)重要，最為經(jīng)典的檢測方法則是T7E1酶切鑒定法，該方法對于切割效率較高的靶點，檢測效果明顯，而對敲除效率不高的靶點，則效果不佳。那么，針對敲除效率不高但又必須要敲除的靶基因，該如何進行敲除效率檢測呢？本文介紹了一種基于基因組PCR產(chǎn)物的sanger法來判定靶點的敲除效率，其靈敏度遠高于T7E1酶切法！”

—

CRISPR/CAS9技術(shù)簡介

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）規(guī)律成簇間隔短回文重復，是源于細菌的一種適應性免疫防御，其作用是清除浸入菌體內(nèi)的病毒或非本體的DNA。后來經(jīng)過科學工作者的研究、改造和優(yōu)化，可以實現(xiàn)對原核細胞和真核細胞的基因組進行基因的敲除、敲入、激活或者抑制等操作的一項新的生物技術(shù)。

CRISPR的基本結(jié)構(gòu)由三個部分組成，即，一個前導區(qū)(Leader)、多個短而高度保守的重復序列區(qū)(Repeat)和多個間隔區(qū)(Spacer)組成。（1）前導區(qū)(Leader)，位于CRISPR結(jié)構(gòu)的上游區(qū)域，序列長度在300～500bp之間，其中AT含量較高是啟動子序列；（2）重復序列區(qū)(Repeat)，序列長度為21～48bp，含有回文序列，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；（3）間隔區(qū)(Spacer)，該序列區(qū)穿插在重復序列區(qū)(Repeat)之間，序列長度在26～72bp的之間。

CRISPR工作原理是CRISPR-derived RNA (crRNA) 通過堿基配對與 tracrRNA (trans-activating RNA) 結(jié)合形成 tracrRNA/ crRNA 復合體，此復合體招募CRISPR核酸酶聚集于crRNA配對的序列靶位點處，并且對靶位點DNA雙鏈進行切割，細胞通過同源修復機制對斷裂后的DNA雙鏈進行修復，研究者可根據(jù)同源修復機制的原理，設計相關(guān)的實驗對靶基因進行編輯（如：去除和/或添加新基因）。

—

T7E1酶切鑒定法

T7 核酸內(nèi)切酶 I （T7E1）識別并切割不完全配對 DNA、十字型結(jié)構(gòu) DNA、Holliday 結(jié)構(gòu)或交叉 DNA、異源雙鏈DNA 或者以更慢的速度切割或切刻雙鏈 DNA。該酶切割錯配堿基 5′ 端的第一、第二或第三個磷酸二酯鍵。

在CRISPR/CAS9陽性克隆檢測中常會出現(xiàn)——假陽性和弱陽性。

假陽性多由于T7E1酶識別了非CRISPR/CAS9切割修復導致的堿基錯配，譬如，識別了十字交叉，holiday結(jié)構(gòu)等。

弱陽性，主要是由于靶點gDNA的序列結(jié)構(gòu)復雜或異常導致的。

T7E1酶切法檢測突變體實驗步驟

PCR擴增出帶有突變位點(如TALEN or CRISPR/Cas9的target site)DNA片段，長度約500bp，突變位點最好不位于PCR片段中央，這樣將切割出兩條大小不同的帶。
以混合克隆細胞株gDNA（或者突變體DNA與野生型DNA混合）為模板，經(jīng)過PCR擴增后的產(chǎn)物，按如下體系進行混合，進行加熱變性、退火復性處理。
上述產(chǎn)物用T7E1酶的酶切處理后（37℃水浴， 1h~1.5h），用2% agrose DNA 電泳鑒定檢測。如可以切出兩條帶的為有效靶點，反之為無效靶點，有效靶點電泳如下圖。

—

Sanger測序

Sanger法測序是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見DNA堿基序列的一種方法。在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用于DNA測序的技術(shù)主要有Frederick Sanger發(fā)明的Sanger雙脫氧鏈終止法（Chain Termination Method）。

—

實戰(zhàn)：不一樣的CRISPR/CAS9靶點活性驗證

針對目的基因或序列的sgRNA構(gòu)建完畢后，都需要進行該位點的活性檢測實驗，對于高敲除效率的靶點當然不用擔心后續(xù)實驗問題（如下圖泳道2），但對于靶點敲除效率不高的咋辦呢？（如下圖泳道4）

對于假陽性或弱陽性是否有其他的檢測方法？

亦或是否有其他簡潔、經(jīng)濟、有效的敲除效率檢測方法？

有！PCR產(chǎn)物Sanger測序！

1. A基因CON；2. A基因T7E1酶切；3.B基因CON；4. B基因T7E1酶切 ; 5.實驗陽性對照。

Sanger測序驗證敲除有效流程

gDNA模板PCR產(chǎn)物測序驗證法和用T7E1酶切的驗證方法的前期實驗和要求路線基本一致，PCR擴增出帶有突變位點(如TALEN or CRISPR/Cas9的target site)DNA片段，長度約500bp，突變位點最好不位于PCR片段中央，這樣將切割出兩條大小不同的帶。PCR結(jié)束后無需進行退火等步驟直接用PCR擴增引物進行Sanger測序驗證。