多細(xì)胞生物是最為重要的進化創(chuàng)新之一，比較多細(xì)胞生物及其近源單細(xì)胞生物的基因組和細(xì)胞特征，對了解多細(xì)胞生物在真核生物中的進化有重要意義。但是，從單細(xì)胞輪藻到多細(xì)胞的輪藻和陸生植物的進化機制，目前尚未可知。

綠色植物可分為兩個門，一類是鏈形生物，包括營淡水生輪藻和所有陸生植物，另一類是綠藻。其中，輪藻植物較為復(fù)雜，有單細(xì)胞的，也有多細(xì)胞的，其中兩個主要的譜系Mesostigma和 Chlorokybus是最早分化的鏈形生物。多細(xì)胞輪藻與陸生植物關(guān)系最近，所以多細(xì)胞輪藻包含很多與陸生植物相同的生物特征。

目前，所有得到基因組的鏈形生物均為多細(xì)胞輪藻和陸生植物，仍沒有單細(xì)胞輪藻基因組報道，這不利于研究植物的多細(xì)胞化進程。Mesostigma viride是一種細(xì)胞表面覆有籃子狀鱗屑的無細(xì)胞壁的單細(xì)胞輪藻，是最早分化的鏈形植物之一，這使得Mesostigma viride成為研究多細(xì)胞生物的進化和陸生植物起源的理想材料。

圖1 Mesostigma viride的細(xì)胞結(jié)構(gòu)

Mesostigma viride的品系NIES-296。

1、Mesostigma viride細(xì)胞結(jié)構(gòu)；

2、Mesostigma viride基因組測序、組裝及注釋；

3、不同處理條件下Mesostigma viride基因組表達(dá)分析；

4、Mesostigma viride與綠藻、輪藻、陸生植物的比較基因組分析；

5、Mesostigma viride全基因組甲基化分析。

1、Mesostigma viride基因組組裝

基于162x Illumina數(shù)據(jù)、113x PacBio數(shù)據(jù)和113x的光學(xué)圖譜數(shù)據(jù)，組裝得到Mesostigma viride的基因組，基因組大小442Mb，scaffolds數(shù)量為2363個，N50為2.6Mb。BUSCO評估基因組完整度為90.1%，預(yù)測得到24431蛋白編碼基因。

表1 Mesostigma viride基因組組裝結(jié)果

2、基因組進化

與選擇的18個綠色植物相比，Mesostigma viride基因組中接近一半的基因為該物種特異基因，其他物種都不含這些基因。在進化樹上，Mesostigma viride處在鏈形植物的基部分枝，這再一次驗證了它是最早分化的綠色植物?；蚣易鍞?shù)量變化表明，基因家族的數(shù)量與物種形態(tài)的復(fù)雜性似乎為相關(guān)，比如從單細(xì)胞的Mesostigma viride到多細(xì)胞的Klebsormidium nitens，從布氏輪藻到地錢、小立碗蘚等無維管束的早期分化陸生植物，從無維管束的早期分化陸生植物到開花植物，基因家族的數(shù)量都呈現(xiàn)出凈增長。同時發(fā)現(xiàn)，從單細(xì)胞Mesostigma viride到多細(xì)胞Klebsormidium nitens的進化過程中，轉(zhuǎn)運相關(guān)基因家族數(shù)量顯著增多，從而增加了細(xì)胞間交流。另外通過比較基因序列相似性，發(fā)現(xiàn)Mesostigma viride與早期分化的陸生植物的基因序列相似度較綠藻植物更高，反映出Mesostigma viride與陸生植物更近，而和綠藻關(guān)系遠(yuǎn)。

圖2 18個綠色植物基因組成及進化關(guān)系

3、基因組加倍和重復(fù)序列

Mesostigma viride基因組中含有大量片段重復(fù)，推測可能發(fā)生過全基因組復(fù)制事件。Mesostigma viride基因組重復(fù)序列占66.02%，其含量與多細(xì)胞輪藻C. braunii相似，但要顯著高于早期分化的陸生植物地錢和小立碗藻。重復(fù)序列以LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子為主，而且LTR序列較長，這也是為什么Mesostigma viride基因組相對于其他綠藻來說較大的原因。Mesostigma viride中的重復(fù)序列集中在內(nèi)含子上，從而增加了其編碼基因的平均長度，比較顯示Mesostigma viride的基因長度比陸生植物要長。

圖3 Mesostigma viride基因組中的片段重復(fù)

圖4 Mesostigma viride基因組中重復(fù)序列

4、從單細(xì)胞到多細(xì)胞再到陸生植物的進化分析

4.1 輪藻與綠藻的分化

輪藻和綠藻是最早分化的綠色植物，它們在形態(tài)、生理和分子特征上存在差異。作者比較了多個輪藻與綠藻的基因組，發(fā)現(xiàn)輪藻中富集了很多與陸生植物相關(guān)的Go term，如種子萌發(fā)正調(diào)控、根發(fā)育、花序發(fā)育、氣孔復(fù)合體等，而這些GO term在綠藻是沒有的，這也再次驗證了陸生植物起源于輪藻而非綠藻。表達(dá)層面分析顯示，當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化時，Mesostigma viride中與陸生植物發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量也會隨著發(fā)生顯著變化。

 4.2細(xì)胞分裂與細(xì)胞壁合成

從單細(xì)胞輪藻到多細(xì)胞陸生植物的進化過程中，細(xì)胞分裂機制經(jīng)歷了很多適應(yīng)性進化。作者分析了單細(xì)胞Mesostigma viride、多細(xì)胞K. nitens、多細(xì)胞C. braunii、擬南芥以及單細(xì)胞綠藻C. reinhardtii（前四個物種為鏈形植物，最后一個為綠藻）基因組與細(xì)胞分裂、細(xì)胞壁形成以及胞間交流相關(guān)的基因。雖然Mesostigma viride單細(xì)胞生物，但在其基因組中發(fā)現(xiàn)很多調(diào)控細(xì)胞成膜體、胞間交流的基因的同源基因，不過這些基因在Mesostigma viride中卻不參與以上過程，而是有其他新功能。同時發(fā)現(xiàn)，很多與細(xì)胞壁合成相關(guān)的基因在多細(xì)胞輪藻和陸生植物基因組存在，但是在Mesostigma viride卻不存在。

 4.3轉(zhuǎn)錄調(diào)控

Mesostigma viride基因組中共有123個轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子可分為31個家族。大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄因子是綠色植物共有的，但其基因家族個數(shù)卻是已知鏈形生物中最少，這可能是由于它有著最簡單形態(tài)結(jié)構(gòu)。同時發(fā)現(xiàn)，Mesostigma viride的轉(zhuǎn)錄因子占所有蛋白編碼基因的比例是所有已知鏈形生物中最低的（僅0.5%），這也證實了轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量會隨著有機體復(fù)雜性的增加而增加。另外，通過分析Mesostigma viride與陸生植物之間共有的轉(zhuǎn)錄因子，將有助于了解這類轉(zhuǎn)錄因子的祖先類型。

圖5 Mesostigma viride基因組中的基因家族

4.4植物激素

前人研究顯示，多細(xì)胞輪藻K. nitens中檢測到生長素，脫落酸、細(xì)胞分裂素、茉莉酸等植物激素，說明植物激素在輪藻早期就已經(jīng)存在。然而，在Mesostigma viride基因組中幾乎沒有找到這些植物激素合成基因的同源基因，同時基因組中也缺少調(diào)控激素轉(zhuǎn)運、感知、信號傳遞的基因的同源基因，說明在基因?qū)用?/span>Mesostigma viride并不具備合成植物激素的能力。但該結(jié)果卻與在Mesostigma viride中檢測到植物激素的結(jié)果相左，可想而知，在Mesostigma viride中存在的少數(shù)幾個激素相關(guān)基因最初可能行使其他生物功能，在進化過程中被賦予了調(diào)控植物激素的新功能。

 4.5表觀調(diào)控

Mesostigma viride基因組中含有很多在真核生物中發(fā)現(xiàn)的與表觀調(diào)控相關(guān)基因的同源基因，同時發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)水平會隨著生長環(huán)境的變化而發(fā)生動態(tài)變化，說明綠色植物響應(yīng)環(huán)境變化的表觀調(diào)控現(xiàn)象至少在輪藻中就已經(jīng)存在了。作者通過LC-MS/MS和WGBS方法分析了Mesostigma viride基因組5mC甲基化程度，發(fā)現(xiàn)5mC在基因組廣泛存在，其中CG類型最為豐富，并且轉(zhuǎn)錄起始位點甲基化水平低，轉(zhuǎn)錄終止位點甲基化程度高?；虮磉_(dá)量與基因啟動子甲基化水平相反，而與基因本身的甲基化成正相關(guān)，這也與陸生植物是一致的

圖6 Mesostigma viride基因組中甲基化情況

4.6小RNA分析

通過分析Mesostigma viride基因組，發(fā)現(xiàn)其中有多個調(diào)控miRNA加工蛋白的直系同源基因，同時結(jié)合小RNA測序，也檢測到多個pre-miRNA，對其中多個pre-miRNA及其靶基因的qPCR分析發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)控其靶基因的表達(dá)。以上結(jié)果說明miRNA的調(diào)控基因表達(dá)的機制是鏈形植物的古老特征。

圖7 高低pH脅迫下Mesostigma viride基因組中特定miRNA的表達(dá)變化

4.7 RNA甲基化

m6A是真核生物中最為常見的mRNA表觀修飾，但是作者在Mesostigma viride中沒有檢測到已知的m6A甲基化所需的直系同源基因，也沒有檢測到m6A的甲基化信號，暗示m6A甲基化對于單細(xì)胞生物來說是非必需的。

4.8 有性生殖

以減數(shù)分裂方式進行有性生殖被認(rèn)為是真核生物的古老特征，在Mesostigma viride基因組中檢索到了多個減數(shù)分裂特異蛋白基因，這暗示了有性生殖在鏈形植物早期分化的物種就已經(jīng)存在。

 5、環(huán)境脅迫響應(yīng)

通過轉(zhuǎn)錄組分析，作者研究了不同環(huán)境脅迫（高低溫、強弱光照、高低PH等）處理下Mesostigma viride轉(zhuǎn)錄組變化情況。

作者發(fā)現(xiàn)高溫處理前后，大量基因出現(xiàn)表達(dá)差異，這些差異富集在很多生物過程（如氧化還原調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)伴隨和修復(fù)、DNA損傷檢測和修復(fù)、麥芽糖、硫和輔酶代謝），Mesostigma viride表現(xiàn)出的細(xì)胞脅迫響應(yīng)與所有生物體是一致的。但是，有一些陸生植物中存在的脅迫響應(yīng)基因在多細(xì)胞輪藻K. nitens和高等分支輪藻中也有報道，但是在Mesostigma viride中卻沒有發(fā)現(xiàn)這些基因的同源基因，說明植物中一些典型的壓力脅迫響應(yīng)可能不存在于Mesostigma viride中。

光照脅迫下，鑒定得到一些差異表達(dá)基因，這些基因涉及到光合作用、光系統(tǒng)II組裝、葉綠素生物合成過程和類囊體膜組織等過程，同時作者在Mesostigma viride中也檢測到了光依賴性光合活性的主要蛋白，以上結(jié)果說明陸地植物的通用光合作用體系已經(jīng)在在初級的鏈形植物上建立起來了。

圖8 不同環(huán)境條件脅迫下Mesostigma viride轉(zhuǎn)錄組分析

         該研究不但揭示了植物從單細(xì)胞到多細(xì)胞的進化與陸生植物的起源機制，其闡述的表觀遺傳調(diào)控基因表達(dá)、光合途徑進化以及響應(yīng)逆境脅迫等機制，將為高等植物如糧食作物抗逆、提高光合效率乃至品種改良方面的基礎(chǔ)研究和育種應(yīng)用提供了新思路，具有重要的指導(dǎo)意義。

Liang, Z., Geng, Y., Ji, C., Du, H., Wong, C. E., Zhang, Q., Zhang, Y., Zhang, P., Riaz, A., Chachar, S., Ding, Y., Wen, J., Wu, Y., Wang, M., Zheng, H., Wu, Y., Demko, V., Shen, L., Han, X., Zhang, P., Gu, X., Yu, H., Mesostigma viride Genome and Transcriptome Provide Insights into the Origin and Evolution of Streptophyta. Adv. Sci. 2019, 1901850. https:///10.1002/advs.201901850