獲得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)常用的有x線晶體學(xué)、NMR和電子顯微鏡三維重組等技術(shù)，x線晶體學(xué)可在原子分辨率水平上分析蛋白質(zhì)的精細三維結(jié)構(gòu)，是目前最主流，分辨率晟高的方法，因而是結(jié)構(gòu)生物學(xué)最有效的手段，基于篇幅，這里只介紹x線晶體學(xué)。x線晶體學(xué)的關(guān)鍵在于是否能夠獲得高度有序的、衍射分辨率高于4A的蛋白質(zhì)單晶。蛋白質(zhì)結(jié)晶的第一步是選擇合適的緩沖液溶解此蛋白以形成穩(wěn)定的蛋白溶液，再加入沉淀劑促使蛋白溶液過飽和到結(jié)晶，因而蛋白的結(jié)晶經(jīng)由三個階段：①蛋白溶液的飽和；②過飽和并形成品核；③晶體生長。

影響蛋白晶體生長的因素包括：①蛋白純度；②沉淀劑；③溶液pH值；④緩沖體系：⑤蛋白濃度；⑥有機溶劑；⑦鹽類或離子；⑧去垢劑；⑨溫度。蛋白結(jié)晶有三個特點：①結(jié)晶是一個反復(fù)實驗的過程，沒有一種理論能夠保證晶體生歐；②每個蛋白都有不同的晶體牛長條件和特點，因而每個樣品必須設(shè)計相應(yīng)的實驗：③很多因素影響晶體的生長，為了得到適合x線衍射的晶體，可能需要試驗幾百甚至上萬個條件，盡管經(jīng)驗可大幅度減少試驗數(shù)量，但大分子的結(jié)晶仍然非常耗時和煩瑣。

氣相擴散法(vapor diffusion)是目前最流行的蛋白結(jié)晶方法，如圖4-4-1所示，含有沉淀劑的結(jié)晶緩沖液置于容器下方的大樣品池中，蛋白液滴位于蓋在容器上方的蓋玻片上。蛋白液滴和結(jié)晶緩沖液形成密閉體系，它們之間通過空氣擴散交換而達到平衡。在此過程中，蛋白質(zhì)液滴中沉淀劑及蛋白質(zhì)的濃度逐漸增加，達到過飽和狀態(tài)，最終析出晶體。目前常用的氣相擴散法包括懸滴法和坐滴法。此法的優(yōu)點在于晶體生長的過程緩慢，蛋白有足夠的時間在晶格中堆積，節(jié)省樣品而且可有效利用儲存空間。

如圖4-4-2所示為一張蛋白晶體衍射照片，利用單波長x線照射在一定角度范圍內(nèi)旋轉(zhuǎn)的蛋白質(zhì)晶體，同時記錄晶體對x光衍射的強度及衍射點的位置。這些強度可轉(zhuǎn)換為結(jié)構(gòu)測定中的結(jié)構(gòu)網(wǎng)子的振幅。

收集到的原始衍射數(shù)據(jù)需要經(jīng)過處理(processing)用于后續(xù)的結(jié)構(gòu)解析。目前最常用的數(shù)據(jù)處理軟件有HKL和XDS等。衍射數(shù)據(jù)的處理一般包括以下幾個步驟：

第一步指標(biāo)化(indexing)，以確定晶胞參數(shù)和格子類型，并預(yù)測全部衍射點的記錄位置；

第二步整合(integration)，包括預(yù)定點位置的強度測量及適當(dāng)背景值的估算；

第三步對稱等效點的比例因子的校正和平均、歸并(scaling)以給出一套獨立數(shù)據(jù)，同時還需要校正隨時間變化的晶體損傷及晶體外形不規(guī)則所造成的吸收效應(yīng)的差別。

有些時候還需要考慮探測器及光源引起的偏差，以及進行特殊的吸收效應(yīng)校正。后修正(postrefinement)可改善不完整衍射點(partiality)強度偏差的估計。強度數(shù)據(jù)最終歸并后(scaling)數(shù)據(jù)處理軟件會給出一系列的與數(shù)據(jù)質(zhì)量相關(guān)的統(tǒng)計參數(shù)。

數(shù)據(jù)的質(zhì)量對結(jié)構(gòu)分析各階段的重要性不言而喻。衡量一套衍射數(shù)據(jù)的質(zhì)量有如下幾個客觀的標(biāo)準(zhǔn)：分辨率、衍射強度R因子、完整度、信噪比和豐度。分辨率越高，數(shù)據(jù)量就越大，根據(jù)此數(shù)據(jù)修正的結(jié)構(gòu)就越精確可靠，確定一套數(shù)據(jù)分辨率的通用標(biāo)準(zhǔn)是：最高分辨率殼層(shell)的信噪比應(yīng)大于2，完整度大于50％，Rmerge應(yīng)低于50％。通常情況下，整套衍射數(shù)據(jù)的Rmerge不能大于20％，好的數(shù)據(jù)的Rmerge可以小到2％～4％。數(shù)據(jù)的完整性對初始相位及結(jié)構(gòu)測定是很重要的，原始數(shù)據(jù)的完整度應(yīng)超過80%，而且缺失數(shù)據(jù)在倒易空間中應(yīng)隨機分布。全部數(shù)據(jù)的豐度應(yīng)在2～3以上，提高豐度通常會略增加數(shù)據(jù)的Rmerge，但這種情況下最終電子密度圖的準(zhǔn)確性反而會提高。

為了提高數(shù)據(jù)質(zhì)量，用回擺法收集數(shù)據(jù)時應(yīng)考慮如下因素：

①準(zhǔn)直光束的大小應(yīng)與晶體的尺寸相當(dāng)或略小，挑選衍射能力強、衍射點均勻、鑲嵌度小的單晶用于數(shù)據(jù)收集，仔細將晶體調(diào)在中心。

②晶體到探測器的距離在保證一定的分辨率前提下應(yīng)根據(jù)晶胞的大小來決定，晶胞越大距離越遠，避免衍射點的重疊。

③每幅畫面的晶體回擺范圍通常為0．25^。～1^。，晶體回擺范圍小一些可以提高數(shù)據(jù)的信噪比，但還與晶胞大小、晶體鑲嵌度有關(guān)，晶胞越大回擺范圍應(yīng)越窄，可以避免衍射點重疊，然而晶體的回擺范圍如果小于晶體鑲嵌度則既無法提高信噪比，也無法避免衍射點重疊。

④曝光時間取決于麈好的統(tǒng)計計數(shù)與x線下晶體有限的壽命之間的平衡。如果晶體耐受x線，增加曝光時間可以提高數(shù)據(jù)的信噪比，但曝光時間如果過大導(dǎo)致太多的衍射點發(fā)生過飽和現(xiàn)象則會降低數(shù)據(jù)質(zhì)量；如果晶體不耐受x線則應(yīng)減少曝光時間，這樣可以相對多收數(shù)據(jù)，同時根據(jù)晶體的空間群和方位計算最佳數(shù)據(jù)收集策略，以在最小的回擺范圍得到一套完整的數(shù)據(jù)。

⑤盡可能多地收集晶體回擺角度，提高數(shù)據(jù)的豐度以提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

結(jié)構(gòu)因子(F(hkl))從數(shù)學(xué)上可以表達為兩個部分：振幅和相角。通過測量x線衍射點的強度可以得到振幅，但是得不到相角信息。由于結(jié)構(gòu)因子相角的全部信息在收集數(shù)據(jù)時丟失，因此必須通過其他途徑來得到它們的數(shù)值。確定相角是晶體結(jié)構(gòu)分析中的核心問題。解析相角問題的方法通常分為兩類：①無初始模型，需要在蛋白晶體中引入重原子，通過實驗方法求解而得到的實驗相角：②有初始模型，通過分子置換法將初始模型通過旋轉(zhuǎn)和平移擬合到晶胞中相應(yīng)位置從而計算得到的模型相角。