▋  張宇, 趙景民

---

中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心

1  HBV cccDNA與松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）在病毒復(fù)制周期中的作用及結(jié)構(gòu)差異

HBV與肝細(xì)胞表面的鈉-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽等受體結(jié)合入胞后，在細(xì)胞質(zhì)中脫去病毒包膜和核衣殼，其rcDNA的基因組進(jìn)入細(xì)胞核。HBV基因組為環(huán)狀部分雙鏈DNA，約為3.2 kb。負(fù)鏈長度固定，有5′端和3′端，負(fù)鏈5′端共價(jià)結(jié)合一短肽作為合    成負(fù)鏈的引物，負(fù)鏈3′端有5～8 bp的冗余，即3′端結(jié)構(gòu)；HBV正鏈為短鏈，長度不確定，一般為基因組長度的15%～50%，其5′端共價(jià)結(jié)合一個(gè)約18 bp長的寡核糖核苷酸作為合成正鏈的引物。正鏈3′末端一般不固定，這段區(qū)域可借助DNA聚合酶補(bǔ)齊成為雙鏈。cccDNA的形成需要如下步驟（圖1）：

(1)去除連接在負(fù)鏈5′端的病毒聚合酶及其引物，形成pf-rcDNA (proteinfree rcDNA)；

(2)去除正鏈5′端RNA引物；

(3)以負(fù)鏈為模板，補(bǔ)齊病毒DNA正鏈；

(4)將正鏈和負(fù)鏈的首尾連接；

(5)高度螺旋化并與組蛋白等結(jié)合形成cccDNA微小病毒染色體。

以cccDNA為模板轉(zhuǎn)錄前基因組RNA及不同長度的mRNA，翻譯成病毒多種組成蛋白。

在檢測(cè)cccDNA過程中，如何從肝組織中特異性提取cccDNA是非常重要的一步，鑒于rcDNA與cccDNA具有序列同源性，cccDNA的整段鏈信息同樣體現(xiàn)在rcDNA鏈上，且其豐度比cccDNA要高的多，跨缺口PCR難以完全區(qū)分cccDNA和rcDNA，如何避免rcDNA污染是準(zhǔn)確檢測(cè)的前提條件，是cccDNA檢測(cè)中最關(guān)鍵的步驟。基于cccDNA和rcDNA結(jié)構(gòu)的差異，可通過跨正負(fù)鏈缺口設(shè)計(jì)引物探針特異性擴(kuò)增cccDNA，或在cccDNA提取過程中通過核酸酶處理樣本中的非cccDNA，以減少非特異性污染。例如檢測(cè)樣本經(jīng)質(zhì)粒安全ATP依賴DNA酶（PSAD）、核酸外切酶Ⅰ&Ⅲ、T5核酸外切酶等預(yù)處理以消化包括rcDNA等非共價(jià)閉合環(huán)狀形式的所有核酸形式，起到相對(duì)純化cccDNA模板的作用。但這依然不能完全排除rcDNA的污染，因?yàn)槠溥€有一條完整鏈可以避免DNA酶的處理，需要在檢測(cè)過程中考慮到這一重要技術(shù)問題。

2  HBV cccDNA的檢測(cè)方法及其臨床應(yīng)用

2.1  Southern Blotting

Southern Blotting是檢測(cè)HBV cccDNA的經(jīng)典方法，但是其檢測(cè)步驟繁瑣且耗時(shí)，包括探針制備、電泳、轉(zhuǎn)膜雜交以及顯影檢測(cè)等，難以在臨床檢測(cè)上廣泛推廣。尤其是慢性肝炎患者肝內(nèi)cccDNA水平很低，0.1~1拷貝/細(xì)胞，而Southern Blotting檢測(cè)下限約為10 拷貝/細(xì)胞，限制了Southern Blotting作為有效檢測(cè)手段在臨床上應(yīng)用。但是盡管多年來不斷出現(xiàn)很多新方法被用于定性或定量檢測(cè)cccDNA，Southern Blotting仍然是一種廣泛被大家認(rèn)可的研究方法之一。

2.2  定量PCR

臨床需更靈敏的HBV cccDNA檢測(cè)技術(shù)的需求催生了PCR檢測(cè)技術(shù)在此方面的應(yīng)用。傳統(tǒng)定量PCR被用于檢測(cè)cccDNA可以追溯至1993年，通過設(shè)計(jì)一對(duì)跨缺口的cccDNA特異性引物來達(dá)到檢測(cè)目的。由于rcDNA的正鏈和負(fù)鏈上均存在缺口，故可設(shè)計(jì)跨越兩個(gè)缺口的引物(圖1)，使rcDNA不會(huì)被擴(kuò)增。在定量PCR的基礎(chǔ)上，研究人員發(fā)展出一系列的改進(jìn)措施來增加反應(yīng)的特異性。Addison等發(fā)展出競(jìng)爭(zhēng)定量PCR，通過雙模板設(shè)計(jì)（已知數(shù)量且與cccDNA同源序列的競(jìng)爭(zhēng)模板與未知數(shù)量待檢測(cè)的目標(biāo)模板），競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合cccDNA特異性引物（圖2）。

在PCR 進(jìn)行時(shí), 兩者在同一反應(yīng)管內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)同一引物, 但競(jìng)爭(zhēng)子和目標(biāo)模板的PCR產(chǎn)物長度是不同的，兩者在凝膠電泳時(shí)很容易區(qū)分開，因此可利用Southern電泳方法檢測(cè)，因?yàn)镻CR產(chǎn)物的大小不同，通過計(jì)算已知競(jìng)爭(zhēng)模板與未知目標(biāo)模板之間檢測(cè)量的差異獲得檢測(cè)結(jié)果。該檢測(cè)方法與傳統(tǒng)Southern Blotting比較，由于模板量增加而增加檢測(cè)靈敏度。相對(duì)于普通定量PCR方法，由于cccDNA特異性引物與rcDNA的低結(jié)合度而使檢測(cè)特異性有所提高，但在高濃度rcDNA情況下尚不能完全排除其對(duì)cccDNA檢測(cè)帶來的污染。除此之外，實(shí)驗(yàn)人員還設(shè)計(jì)了巢式PCR，通過兩對(duì)引物兩次PCR的設(shè)計(jì)來增加反應(yīng)的特異性。研究人員通過巢式PCR檢測(cè)cccDNA而鑒定隱匿性HBV感染，探討隱匿性HBV感染對(duì)“隱源性”肝癌的發(fā)生進(jìn)行評(píng)估。其檢測(cè)結(jié)果表明73%入組的不明原因HCC患者與HBV隱匿性感染有關(guān)，且非腫瘤組織的檢出率高于腫瘤組織。

對(duì)于cccDNA特異性擴(kuò)增定量檢測(cè)，cccDNA的選擇性分離和富集是必需的。2015年，磁性納米粒子首次被引入捕獲特定的cccDNA。利用這種方法將捕獲的cccDNA通過變性釋放并進(jìn)一步加工用于傳統(tǒng)的定量PCR。通過這樣的設(shè)計(jì)一定程度上提高了檢測(cè)的特異度和靈敏度。

CHB患者臨床上抗病毒治療后，痕量的cccDNA在感染細(xì)胞的細(xì)胞核中持續(xù)存在，而微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)系統(tǒng)的發(fā)展大大提高了cccDNA檢測(cè)技術(shù)的靈敏度，為這一臨床問題的解決提供了途徑。樣本被分離成數(shù)以萬計(jì)“油包水”液滴，每一個(gè)液滴都是一個(gè)獨(dú)立的傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系。倘若液滴內(nèi)含有目標(biāo)序列，會(huì)呈現(xiàn)出可檢測(cè)的熒光信號(hào)。反之，則是陰性信號(hào)。最終的檢測(cè)結(jié)果顯示熒光信號(hào)呈現(xiàn)一種泊松分布。該方法可檢測(cè)低至單拷貝的cccDNA載量。Huang等利用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)針對(duì)HBV感染不同階段的乙型肝炎患者（CHB、肝硬化、肝癌）體內(nèi)cccDNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示肝癌患者體內(nèi)cccDNA水平顯著高于肝炎及肝硬化患者，這提示cccDNA可能在肝癌發(fā)生中發(fā)揮著一定的作用。但是該技術(shù)操作過程中即使經(jīng)過PSAD的消化作用以去除非環(huán)狀DNA的影響以及特異性引物的設(shè)計(jì)，并不能去除假陽性存在的可能。

2.3  滾環(huán)PCR

除此之外，滾環(huán)擴(kuò)增是cccDNA檢測(cè)中一種重要方法，尤其是在石蠟包埋組織中。由于組織固定劑隨著固定條件及固定時(shí)間導(dǎo)致DNA的降解及甲基化等原因，石蠟包埋肝組織中的cccDNA含量比新鮮冷凍保存組織要低100多倍，一般定量PCR不能滿足檢測(cè)條件，通過滾環(huán)擴(kuò)增模板并結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)大檢測(cè)技術(shù)的靈敏度，減少整合HBV DNA的影響，而使得臨床常規(guī)石蠟包埋肝組織樣本中cccDNA檢測(cè)得以實(shí)現(xiàn)。

趙景民和徐東平團(tuán)隊(duì)對(duì)這一方法在臨床檢測(cè)方面進(jìn)行一系列的研究工作，率先建立了適用于臨床應(yīng)用的滾環(huán)擴(kuò)增聯(lián)合跨缺口引物PCR HBV cccDNA定量檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了利用微量石蠟肝組織切片檢測(cè)cccDNA的技術(shù)突破。

國際上cccDNA檢測(cè)方法主要基于新鮮肝穿刺組織且難以定量，限制了其臨床推廣應(yīng)用。團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一種基于常規(guī)石蠟切片的滾環(huán)聯(lián)合跨缺口引物擴(kuò)增的HBV cccDNA熒光定量新技術(shù)，解決了這一難題，首次明確了cccDNA評(píng)價(jià)治療終點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)閾值，獲臨床應(yīng)用準(zhǔn)入，取得顯著的臨床和社會(huì)效益。該技術(shù)是在以往實(shí)時(shí)熒光定量PCR之前增加了一步跨缺口滾環(huán)擴(kuò)增，由于非cccDNA形式的HBV在基因結(jié)構(gòu)上是不完全的雙鏈環(huán)狀或線狀，滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)不能連續(xù)進(jìn)行，只有cccDNA才能獲得特異性地大量擴(kuò)增。該技術(shù)最低可檢測(cè)到10個(gè)拷貝的cccDNA分子，并可獲得所有擴(kuò)增cccDNA的全基因序列。

以上cccDNA檢測(cè)技術(shù)都只是進(jìn)行定量檢測(cè)，而無法進(jìn)行定位及分布檢測(cè)。該研究團(tuán)隊(duì)在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展石蠟包埋肝組織切片原位PCR檢測(cè)cccDNA，其可以原位擴(kuò)增顯示cccDNA含量，也避免了Southern Blotting一系列復(fù)雜的操作步驟，同時(shí)相對(duì)于原位雜交來說，可以將低拷貝的cccDNA通過擴(kuò)增檢測(cè)出來。通過預(yù)先的PSAD酶處理消化去除了非cccDNA的影響，配合特異性標(biāo)記跨缺口引物的使用，使得整體敏感度和特異度都有很大提高，還可以在分子病理上將組織形態(tài)與cccDNA定位分布較好地聯(lián)系起來，該方法的建立對(duì)深入了解cccDNA在HBV致病機(jī)理、評(píng)價(jià)抗病毒療效以及探討乙型肝炎治療的新途徑提供分子病理學(xué)基礎(chǔ)。

2.4  原位雜交

原位雜交應(yīng)用于檢測(cè)cccDNA可起始于1998年，利用DIG標(biāo)記的單鏈探針檢測(cè)感染HBV的細(xì)胞內(nèi)cccDNA水平，但是并沒有檢測(cè)肝組織內(nèi)cccDNA水平。這一技術(shù)一直較少應(yīng)用至臨床檢測(cè)，而Zhang等對(duì)這一技術(shù)的改進(jìn)，大大提高了其靈敏度和特異度，可原位檢測(cè)cccDNA并且可以在單細(xì)胞的水平檢測(cè)HBV RNA、DNA和cccDNA，并通過其嚴(yán)格的核內(nèi)信號(hào)和一系列Southern Blotting分析得到證實(shí)cccDNA探針組的特異度。使用該原位測(cè)定結(jié)合免疫組化或免疫熒光發(fā)現(xiàn)了令人驚訝的病毒抗原和核酸的鑲嵌分布。最引人注目的是，在HBV表面抗原陽性與HBV DNA及cccDNA陽性細(xì)胞之間發(fā)現(xiàn)了相互排斥的模式。在1年的阿德福韋治療期間對(duì)患者進(jìn)行縱向觀察證實(shí)了病毒DNA核儲(chǔ)存的持續(xù)存在，盡管這些個(gè)體中細(xì)胞質(zhì)DNA被有效消耗。該方法對(duì)臨床檢測(cè)單細(xì)胞水平上病毒核酸（包括cccDNA）的應(yīng)用，提供了監(jiān)測(cè)慢性HBV感染中的肝內(nèi)病毒學(xué)載量及分布的手段。更重要的是，該方法的應(yīng)用揭示了體內(nèi)HBV生命周期的復(fù)雜性。

2.5  檢測(cè)方法的選擇

目前，cccDNA檢測(cè)尚未有標(biāo)準(zhǔn)、高效的檢測(cè)方法，也是臨床亟待解決的問題之一。在已有的檢測(cè)方法中，Southern Blotting作為一種經(jīng)典方法，其結(jié)果可靠且可重復(fù)性較好，但操作繁瑣耗時(shí)，靈敏度不高，更多作為實(shí)驗(yàn)室技術(shù)使用。定量PCR近年來發(fā)展迅速，其操作簡(jiǎn)單，可高通量檢測(cè)，其中競(jìng)爭(zhēng)定量PCR的靈敏度比Southern Blotting方法要高，可從電泳條帶上區(qū)分rcDNA和cccDNA，但當(dāng)rcDNA含量較高時(shí)，這種條帶區(qū)分方法受到限制。微滴式數(shù)字PCR相對(duì)于傳統(tǒng)PCR來說，其靈敏度得到很大的提升，因此針對(duì)病毒低拷貝的患者肝內(nèi)cccDNA檢測(cè)具有一定的優(yōu)勢(shì)，但當(dāng)模板載量高于106拷貝時(shí)，其理論值與實(shí)際值之間存在偏差。筆者團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了滾環(huán)擴(kuò)增聯(lián)合跨缺口引物PCR設(shè)計(jì)并將其應(yīng)用于石蠟組織切片中，極大地?cái)U(kuò)大了臨床樣本使用范圍，可以在單細(xì)胞水平定位或定量檢測(cè)cccDNA，并與組織形態(tài)變化相聯(lián)系，但固定液引起的蛋白交聯(lián)或DNA甲基化可能會(huì)影響PCR擴(kuò)增效果，需綜合考慮檢測(cè)結(jié)果。有研究者通過對(duì)原位雜交技術(shù)的改良，結(jié)合支鏈DNA(branched DNA, bDNA)擴(kuò)增放大信號(hào)和熒光標(biāo)記，能夠?qū)崿F(xiàn)可視可定位特異性檢測(cè)cccDNA，但是其檢測(cè)探針設(shè)計(jì)復(fù)雜，技術(shù)要求較高。

3  HBV cccDNA與血清學(xué)標(biāo)志物的關(guān)系

血清中HBV DNA水平是指導(dǎo)抗病毒治療非常重要的臨床指標(biāo)，與肝內(nèi)cccDNA水平顯著相關(guān)，但是核苷酸類似物抗病毒治療雖然能使血清中HBV DNA迅速轉(zhuǎn)陰，但是對(duì)肝內(nèi)cccDNA作用有限。若在此時(shí)停藥往往會(huì)出現(xiàn)病毒學(xué)反彈甚至病情加重。而即使接受長達(dá)10年以上的抗病毒治療，且血清中HBV DNA水平持續(xù)低于檢測(cè)下限，但肝內(nèi)仍然可以檢測(cè)到cccDNA，因此如何聯(lián)合其他血清中的病毒學(xué)指標(biāo)來更準(zhǔn)確地反映肝內(nèi)cccDNA存在與復(fù)制情況是目前臨床檢測(cè)的挑戰(zhàn)之一。

有研究顯示，血清中HBV RNA和乙型肝炎核心相關(guān)抗原（HBcrAg）水平在HBV DNA低于檢測(cè)下限后可以很好地應(yīng)用于抗病毒治療中病毒學(xué)應(yīng)答的檢測(cè)，并反映肝內(nèi)cccDNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄情況，但這一結(jié)果是否可應(yīng)用于指導(dǎo)確定臨床抗病毒治療停藥終點(diǎn)尚待進(jìn)一步研究。

HBsAg消失是臨床治愈目標(biāo)，研究表明長期抗病毒治療伴隨著HBsAg和cccDNA明顯降低，但是HBeAg陰轉(zhuǎn)后，血清HBsAg與cccDNA相關(guān)性顯著下降，而且低水平HBsAg陽性并不意味著肝內(nèi)一定有cccDNA存在，實(shí)驗(yàn)證明整合HBV DNA也是HBsAg分泌來源之一。

此外，檢測(cè)肝組織中cccDNA對(duì)于了解HBV感染者病情和傳染性有參考價(jià)值，尤其對(duì)于隱匿性HBV感染（OBI），cccDNA檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展增強(qiáng)了對(duì)這一臨床問題的認(rèn)識(shí)。Caviglia等對(duì)OBI患者肝內(nèi)cccDNA進(jìn)行檢測(cè)，并與血清中抗-HBc IgG水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明抗-HBc IgG抗體可以反映肝內(nèi)cccDNA水平，提示OBI患者病毒再激活的可能性，尤其是接受免疫抑制劑治療或免疫功能低下的特殊人群需要臨床上關(guān)注。

4  HBV cccDNA檢測(cè)的臨床意義

HBV cccDNA水平被認(rèn)為是一個(gè)有價(jià)值的反映肝內(nèi)病毒復(fù)制水平的標(biāo)志物，在臨床抗HBV治療期間檢測(cè)cccDNA的變化，有助于判斷臨床療效以及治療策略的調(diào)整。目前CHB患者抗病毒治療的理想治療終點(diǎn)是臨床治愈，即血清HBsAg消失，伴有或不伴有抗-HBs陽轉(zhuǎn)，但此時(shí)肝內(nèi)依然可能存在cccDNA復(fù)制。而達(dá)到徹底治愈，除卻血清中HBsAg以及HBV DNA檢測(cè)不到，肝內(nèi)cccDNA和整合HBV DNA都被清除，因此可靠的cccDNA檢測(cè)技術(shù)對(duì)于判定CHB的臨床治愈情況至關(guān)重要。

4.1  抗HBV治療中的指導(dǎo)作用

目前普遍為大家所接受的觀點(diǎn)認(rèn)為，抗病毒治療過程中，即使發(fā)生了HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，肝內(nèi)依然存在病毒復(fù)制，只有徹底清除了肝細(xì)胞內(nèi)的cccDNA才能實(shí)現(xiàn)徹底治愈，因?yàn)閏ccDNA是HBV復(fù)制的原始模板。臨床中有很多經(jīng)過長期抗病毒治療完全應(yīng)答的患者，停止抗病毒治療后，又常常發(fā)生HBV再激活和病情復(fù)發(fā)，而HBV cccDNA在停藥后復(fù)發(fā)中起著重要作用。HBV cccDNA的存在貫穿于乙型肝炎自然史的始終，所以cccDNA 是徹底清除HBV的關(guān)鍵。肝內(nèi)cccDNA可列為抗HBV新藥評(píng)估指標(biāo)，監(jiān)測(cè)其水平也可以輔助評(píng)價(jià)抗病毒療效和預(yù)后，更好地反映病毒復(fù)制的水平、疾病的嚴(yán)重性，顯示出其在臨床診斷和治療中的指導(dǎo)性作用；而通過肝活組織檢查測(cè)定cccDNA的水平，將為抗病毒治療終點(diǎn)的選擇提供客觀依據(jù)。

基于cccDNA在病毒持續(xù)感染與肝炎慢性化中的重要作用，阻斷cccDNA的形成或降解cccDNA已成為抗HBV治療藥物研發(fā)的有潛力的方向。譬如，通過免疫反應(yīng)介導(dǎo)、CRISPR/Cas及RNAi基因編輯技術(shù)或表觀遺傳修飾等途徑清除已有cccDNA；通過阻斷鈉-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽受體譬如Myrcludex B阻斷HBV播散；通過阻斷肝細(xì)胞rcDNA向cccDNA轉(zhuǎn)變等方法，以期達(dá)到徹底清除cccDNA的目的，從而實(shí)現(xiàn)CHB徹底治愈的最終目標(biāo)。

4.2  HBV cccDNA與HBV肝外感染

HBV雖然是一種嗜肝病毒，但在許多肝外的器官（外周血單核細(xì)胞、骨髓、胰腺、腎臟、睪丸、卵巢等）均能檢測(cè)到HBV DNA或病毒抗原的報(bào)道，提示HBV有可能感染肝外器官或發(fā)生肝外定植，甚至有可能導(dǎo)致肝外疾病，如HBV相關(guān)性腎炎。cccDNA作為HBV復(fù)制的模板，是確定肝外器官是否感染HBV和病毒是否存在復(fù)制的最有力證據(jù)，然而，目前尚未有檢測(cè)到肝外組織存在cccDNA的確切證據(jù)。

5  總結(jié)

cccDNA是HBV持續(xù)感染、難以徹底治愈的最大臨床挑戰(zhàn)，通過cccDNA的檢測(cè)能夠了解病毒感染和復(fù)制狀況，評(píng)估疾病進(jìn)展，抗病毒治療停藥終點(diǎn)的確定，評(píng)價(jià)病毒清除的最具代表性的指標(biāo)，也是器官移植后、抗腫瘤治療等免疫功能低下或缺陷HBV再感染或再激活的客觀指標(biāo)。目前cccDNA檢測(cè)方法主要包括滾環(huán)擴(kuò)增聯(lián)合跨缺口引物設(shè)計(jì)的滾環(huán)PCR，基于bDNA信號(hào)擴(kuò)增可定位顯示的原位雜交和以“油包水”微滴化提高靈敏度的微滴式數(shù)字PCR等一系列方法，其中可應(yīng)用于石蠟切片的滾環(huán)PCR的研發(fā)，拓展了cccDNA檢測(cè)技術(shù)的組織樣本應(yīng)用范圍，臨床適用性較好，特異度及敏感度較高，值得臨床應(yīng)用推廣。HBV cccDNA檢測(cè)對(duì)于明確HBV感染及復(fù)制狀況、評(píng)估疾病進(jìn)展、停藥終點(diǎn)的確定、評(píng)價(jià)病毒清除狀況具有重要臨床意義，HBV cccDNA的徹底清除也是CHB臨床治療從臨床治愈到徹底治愈的標(biāo)志性指標(biāo)。