ELISA原理

ELISA利用抗原抗體之間專一性結合之特性，對標本進行檢測；由于結合與固體承載物（一般為塑膠孔盤）上之抗原或抗體仍可具有免疫活性，因此設計 其結合 機制後，配合酵素顯色反應，即可顯示特定抗原或抗體是否存在，并可利用顯色之深淺進行定量分析。根據(jù)待測樣品與結合機制的不同，ELISA可設計出各種不 同類型的檢測方式，主要以"三明治法"(sandwich)、"間接法"(indirect)、以及"競爭法"(Competitive)三種為主，以下 為各種方法之介紹。

ELISA分類

見ELISA的雙抗夾心法原理；

ELISA的雙抗夾心法，又稱"三明治法"。

三明治法常用于檢測大分子抗原，一般之操作步驟為：

將具有專一性之抗體固著(coating)于塑料孔盤上，完成後洗去多馀抗體；
加入待測標本，標本中若含有待測之抗原，則其會與塑料孔盤上的抗體進行專一性結合；
洗去多馀待測標本，加入標記有酵素之二次抗體，與抗原結合；
洗去多馀未結合的二次抗體，加入酵素受體使呈色，以肉眼或儀器讀取顯色結果。

三明治法分別以兩種抗體對標本中的抗原進行兩次專一性辨認，因此專一性相當高，但此待測抗原必須是多價抗原，如此才可獲得兩種以上的專一性抗體，以分別進行夾心；而且此法需要足夠的表位空間以進行抗原抗體的夾心，所以并不適用于半抗原或小分子抗原等分子量較小之標的。

ELISA雙抗夾心法的衍生方法如ABC法：ELISA的生物素 -親和素系統(tǒng)，該產品系列是檢測方法上的重要革命。生物素/親和素系統(tǒng)用于ELISA一般有三種形式，即橋聯(lián)法（BAB）、標記法 （BA）和ABC法，不少學者用之檢測了不同的抗原—抗體系統(tǒng)均取得了較好的結果，其中以BA法和ABC法應用較多，敏感性一般比常規(guī)ELISA法高 4～80倍。

所謂ABC技術是指Avidin : Biotinylated Enzyme Complex Technology，親和素-生物素-過氧化物酶復合物技術，所謂的ABC系統(tǒng)，被普遍視為目前最靈敏、最可靠與最有效的染色系統(tǒng)，并被廣泛應用于免疫 組織化學、免疫電鏡、原位雜交與凝集素化學中。而該系統(tǒng)仍在不斷地發(fā)展，以滿足廣大研究人員的各種不同要求（如多抗原的標記檢測）。

ELISA的間接法：

間接法常用于檢測抗體，一般之操作步驟為：
將已知之抗原固著于塑膠孔盤上，完成後洗去多馀之抗原；
加入待測標本，標本中若含有待測之一次抗體，則其會與塑膠孔盤上的抗原進行專一性結合；
洗去多馀待測標本，加入帶有酵素之二次抗體，與待測之一次抗體結合；
洗去多馀未結合的二次抗體，加入酵素受體使酵素顯色，以肉眼或儀器讀取顯色結果。

ELISA的競爭法原理；

競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制，一般用于檢測小分子抗原，其操作步驟為：
將具有專一性之抗體固著于塑膠孔盤上，完成後洗去多馀抗體；
加入待測標本，使標本中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗體進行專一性結合；
加入帶有酵素之抗原，此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進行專一性結合，由于塑膠孔盤上固著的抗體數(shù)量有限，因此當標本中抗原的量越多，則帶有酵素之抗原可結合的固著抗體就越少，亦即，兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗體結合，即所謂競爭法之由來。
洗去標本與帶有酵素之抗原，加入酵素受體使酵素顯色，當標本中抗原量越多，代表塑膠孔盤內留下的帶有酵素的抗原越少，顏色也就越淺。
當需要檢測無法獲得兩種以上單一性抗體的抗原，或是不易得到足夠的純化抗體以固著在塑膠孔盤上時，一般會考慮使用競爭法ELISA。

ELISA的商品化試劑盒成分和分類：

在臨床檢驗或者科研檢測中，ELISA 實驗通常有商品試劑盒提供。ELISA試劑盒中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物等。

完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；
（2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；
（3）酶的底物；
（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標準品和控制血清（定量測定中）；
（5）酶聯(lián)物（結合物）及標本的稀釋液；
（6）洗滌液；
（7）酶反應終止液。

1、免疫吸附劑

已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個月以上。有些不完整的試盒，僅供應包被用抗原或抗體，檢測人員需自行包被。如BioTNT 網站中，代理的產品，有的是complete的試劑盒，有的是需要再進行包被的duoset，或者是其他的說法，都是不完整的試劑盒。

1.1 固相載體

固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學反應?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯 乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。

ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產品稱為ELISA板，國際上標 準的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標本的檢測，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標準ELISA板相同。ELISA板的 特點是可以同時進行大量標本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結果?，F(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保 溫、比色等步驟，對操作的標準化極為有利。聚苯乙烯經射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增 多，但用于間接法測抗體時空白值較大。

良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔 之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產品的質量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。 常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內加入適當稀釋度的酶標抗人IgG抗體，保溫后洗滌， 加底物顯色，終止酶反應后，分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻獥l件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計算全部讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù) 之差，應小于10%。

與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點為質軟板薄，可剪割，價廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應用如下的試驗：用其他免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本，將它們進行一系列稀釋后，在 不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進行測定，然后比較結果。在哪一種載體上陽性結果與陰性結果差別最大，這種載體就是這一ELISA測定項目的 最合適的固相載體。

在ELISA中，用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠，表面經磨砂處理后吸附面積大大增加。ELISA板孔的吸 附面積約為200mm2，小珠均為1000mm2，將近ELISA板孔的5倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者，球型小珠的表面弧度 更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結合位點的暴露面處于最佳反應狀態(tài)，因此珠式ELISA的反應往往更為靈敏。小珠的另一特點是更易于使洗滌徹底，使用特殊 的洗滌器，使小珠在洗滌過程中滾動淋洗，其洗滌效果遠較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難度較大，小珠的均一性較差。

小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標本的反應量也相應增加。板式及珠式ELISA的標本量一般為00-200ul，而小試管可根據(jù)需要加大反應體積，標本反應量的增加有助于試驗敏感性的提高。小試管還可以當作比色杯，最后直接放入分光光度計中比色。

也有應用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優(yōu)點是表面積極大，反應在懸液中進行，其速率與液相反應近似。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體，反應后用磁鐵的吸引進行分離，洗滌方便，試劑盒一般均配以特殊儀器。

應用于科研領域，定量檢測的試劑盒，對固相載體的要求比較高，一般采用nunc 或者costar，或者其他知名品牌的酶標板，來進行包被。

以下簡述固相載體和包被過程。

1.2 包被的方式

將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結合到固相載體表面的過程。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合 的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用力。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對 不同蛋白質的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附 力，其聯(lián)結多發(fā)生在Fc段上，抗體結合點暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當抗原決定簇存在 于或鄰近于疏水區(qū)域時，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對該 抗原的特異抗體作預包被，其后通過抗原抗體反應使抗原固相化。此間接結合在固相上的抗原遠離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經固相 抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法，試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳。間接 包被的另一優(yōu)點是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測抗 DNA抗體時，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結合。可將聚苯乙烯板先經紫外線照射（例如30W紫外燈，75cm照射12小 時），以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預包被，也可提高核酸的結合力。也可用親和素生物素系統(tǒng)作間接包被，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。

脂類物質無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質自然干固在固相表面?？剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。

1.3 包被用抗原

用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動物組織、微生物 培養(yǎng)物等，須經提取純化才能作包被用。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細菌和病毒抗原可以從其培養(yǎng)物中提取，蛋白成份抗原可從富含此抗原的 材料中提取等（例如AFP從臍帶血或胎肝中提取）。重組抗原是抗原基因在質粒體中表達的蛋白質抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質粒體。重組抗原的優(yōu)點是除工 程菌成份外，其他雜質少，而且無傳染性，但純化技術難度較大。以大腸桿菌為質粒體的重組抗原如不能充分除大腸桿菌成份，用于ELISA，在反應中可出現(xiàn)假 陽性，因不少受檢者受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質。例如丙型肝 炎病毒（HCV）尚不能培養(yǎng)成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測抗HCV ELISA中所用包被抗原大多為根據(jù)HCV的基因克隆表達而 制備的重組抗原。在傳染病診斷中，不少重組抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得應用。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質抗原分子的某 一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無關蛋白質如牛血清白蛋白質（BSA）等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面。應用多肽抗原的另一 注意點為他僅能檢測與其相應的抗體。一種蛋白質抗原往往含有多個不同的能引起抗體產生的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應。 另外，某些微生物發(fā)生變異時往往發(fā)生抗原結構變化，在這種情況下，用個別多肽抗原進行包被可引起其他抗體的漏檢。

1.4 包被用抗體
包被固相載體的抗體應具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液。如免疫用抗原中含有雜質（即便是極微量的），在抗血清中將 出現(xiàn)雜抗體，必須除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性?？寡宀荒苤苯佑糜诎?，應先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和 Sephadex凝膠過濾法。一般經硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG性質不穩(wěn)定。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗的敏感性，則 可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收和親和層析處理，一般可將腹水作適當稀 釋后直接包被，必要時也可用純化的IgG。應用單抗包被時應注意，一種單抗僅針對一種抗原決定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。

1.5 　包被的條件
包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應根據(jù)試驗的特點和材料的性質而選定?？贵w和蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作 為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放 置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的最適當濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協(xié)調選 定。一般蛋白質的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。

1.6 封閉
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無 關蛋白質溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排 斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或 1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用， 但由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。

封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條 件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當反而會使陰性本底增高。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌徹底，不經封閉也可 得到滿意的結果。特別是用單抗腹水直接包被時，因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉 一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。

2.   酶聯(lián)物（結合物）
結合物即酶標記的抗體（或抗原），是ELISA中最關鍵的試劑。良好的結合物應該是 既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當?shù)姆肿颖壤?，在結合試劑中應盡量不含有或少含有游離的（未 結合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結合物尚要有良好的穩(wěn)定性。

2.1   酶
用于ELISA的酶應符合以下要求：純度高，催化反應的轉化率高，專一性強，性質穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，制備成酶結合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢標本中不存在相同的酶。另外，它的相應底物易于制備和保存，價格低廉，有色產物易于測定等。

在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶 (alkaline phosohatase, AP)。在少數(shù)商品ELISA試劑中，應用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。國產 ELISA試劑一般都用HRP制備結合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅 素）結合而成，是一種卟啉蛋白質。主酶無色糖蛋白在275nm波長處有最高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長處有最高吸收峰。HRP的 純度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥?.0。

HRP除符合上述的ELISA中標記酶的要求外，更有價格低廉和性質較穩(wěn)定的特點。值得注意的是，在選用酶制劑時，除其純度RZ外，更應注意酶的活力。 高純度的酶如保存不當，活力也會降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對底物作用后生成產物量的測定進行試驗。

國外很多ELISA 試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標記酶。常用的AP有兩個來源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來源的酶生化特性特性略不相同，從大腸桿菌中提取的 AP分子量為80000，酶作用的最適合pH為8.0；用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000，最適pH為9.6。在ELISA中，AP系統(tǒng)的敏感 度一般高于HRP系統(tǒng)，空白值也較低，但AP價格昂貴，制備結合物所得率也較HRP低。

2 .2  抗原和抗體
制備結合物時所用抗體 一般 均為純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結時其他雜蛋白的干擾。最好用親和層析純的抗體，這樣全部酶結合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反 應，實驗結果本底淺淡。如用F(ab')2進行標記，則更可避免標本中RF的干擾。在ELISA中用酶標抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。

2.3  結合物的制備
酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。
（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以使酶與蛋白質的氨基通過它而聯(lián)結。堿性磷酸一般用此法進行標記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應后即得酶標記抗體。

ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡便、有效（結合率達60%-70%）和重復性好等優(yōu)點。缺點是交聯(lián)反應是隨機的，酶與抗體交聯(lián)時分 子間的比例不嚴格，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。諏講椒ㄖ校?br> 先將酶與戊二醛作用，透析除去多余 的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標抗體。也可先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結。兩步法的產物中絕大部分的酶與蛋白質是以1:1的比例結合的，較一步法 的酶結合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。

（2）過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物 酶的標記常用此法。反應時，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基形成Schiff氏堿而結合。酶標記物按克分子比例聯(lián) 結，其最佳比例為：酶/抗體=1-2/1。此法簡便有效，一般認為是HRP最可取的標記方法，但也有人認為所有試劑較為強烈，各批實驗結果不易重演。 

按以上方法制備的酶結合物一般都混有未結合物的酶和抗體。理論上，結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定，因經過徹底洗滌，游離 酶可被除去，并不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同，它會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，從而減少了結合到固相上的酶標抗體的量。因此制備的酶結合物應 予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法最為簡便，但效果并不理想，因為此法只 能去除留在上清中的游離酶，但相當數(shù)量的游離抗體仍與酶結合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高效液相層析法可將制備的結合物 清晰地分成三個部分：游離酶、游離抗體和純結合物而取得最佳的分離效果，但費用較貴。

結合物制得后，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當?shù)?工作濃度。使用過濃的結合物，既不經濟，又可使本底增高；結合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性。所以必須對結合物的濃度予以選擇。最適的工作濃度就是 指結合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。就酶標抗體本身而言，它的有效工作濃度 是指與其相應抗原包被的載體作試驗時，能得到陽性反應的最高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑標明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經 1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗時，將發(fā)生陽性反應。但在用于具體的ELISA檢測中，酶標抗體的最適工作濃度受到固相載體 的性質、包被抗原或抗體的純度以及整個檢測系統(tǒng)如標本、反應溫度和時間等的影響，因此必須在實際測定條件下進行"滴配"選擇能達到高敏感度的最大稀釋度作 為試劑盒中的工作濃度。

2.4 　結合物的保存
酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質，保存不當，極易失活。高濃度的結合物較為穩(wěn) 定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時需經復溶，頗為不便。結合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普 通冰箱的冰格中較長時間保存。早期的ELISA試劑盒中的結合物一般均按以上兩種形式供應，配以稀釋液（見3.2.5）臨用時按標明的稀釋度稀釋成工作 液?，F(xiàn)在較先進的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達6個月。由于蛋白質濃度較低，結合物易失活， 需加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉），以防止細菌生長。

2.5 　結合物的稀釋液
用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關蛋白質（例如1%牛血清白蛋白）， 通過競爭以抑制結合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時， 血清標本需稀釋后進行測定，也可應用這種稀釋液。

3. 酶的底物

3.1HRP的底物
HRP催化過氧化物的氧化反應，最具代表性的過氧化物為H2O2，其反應式如下：
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經酶作用后成為有色的產物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯 二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和 ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的產物呈橙紅 色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物最常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。 曾有報道OPD有致異變性，操作時應予注意。OPD見光易變質，與過氧化氫混合成底物應用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般 分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸 餾水稀釋。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應用液，只需加入OPD后即可作為底物應用液。

TMB經HRP作用后共產物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另 外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點，因此在ELISA中應用日趨廣泛。酶反應用HCL或H2SO4終止后，TMB產物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸 收波長為405nm。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。

另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，經HRP作用后，產物顯熒光，可用熒光光度計測量。用于ELISA的優(yōu)點為可加寬定量測定的線性范圍。

HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應用最多，但尿素過氧化物為 固體，作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩(wěn)定1年。

3.2　AP的底物
AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產物為黃色 的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光 測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。 

4.     洗滌液 
在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。

5.     酶反應終止液
常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。
 
6.    陽性對照品和陰性對照品
陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結果的對 照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致。以人血清為標本的測定，對照品最好也為人血清，因為正常人血清在各種 ELISA模式中可產生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到，國外試劑盒中的對照品多以復鈣人血漿 (recalcified human plasma)為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相 似。陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質，其中加入一定量的待檢物質，此量最好在試劑說明書中標明。加入的量應與試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較， 可對標本中受檢物質的量有一個粗略的估計。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml，陽性對照品中含量約為10ng/ml。 在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。

7.    參考標準品

定量測定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質癌胚抗原測定等）應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。

其他內容：

酶聯(lián)免疫測定技術的多酶級聯(lián)放大系統(tǒng)：

一、AP底物放大系統(tǒng)

substrate ampiification system
AP可催化底物NADP+脫磷酸而生成NAD+(輔酶1)，以乙醇作還原劑，在醇脫氧酶催比下，乙醇脫氫，NAD+還原為NADH，NADH在黃遞酶的催 化下脫氫，同時四唑鹽(tetrazoliim)被還原成有色的甲蠟(formazan)。AP不斷催化NAD+生成，NAD+與NADH循環(huán)轉化，不斷 生成甲蠟。整個反應周期由AP及醇脫氫酶、黃遞酶組成酶級聯(lián)，每個AP分子每分鐘可催化生成6X104個NAD+分子，而每個NAD+每分鐘又可使60個 甲臘分子產生。這種由Selfl984年首次報道的EIA放大系統(tǒng)可使EIA的測定敏感性提高約250倍。

但Brooks等發(fā)現(xiàn)上述底物反應循環(huán)中產生的乙醛對整個酶級聯(lián)反應有抑制作用，影響放大效果，而當加入鹽酸氨基脲時，則可進一步延長反應循環(huán)，從而增加 測定敏感性，這是因為鹽駿氨基脲可與乙醛反應生成縮氨基脲(semicarbatone)和水，這樣就消除了乙醛對反應的抑制阼用。應用這種改進方法測定 食物中含蛋白A的金黃色葡萄球菌，測定敏感性從Self原方法的(4～6)X103菌落形成單位(c．{．u)/g或m1，到20個菌落形成單位 (c．f．u)/g或ml，測定敏惑性約提高200—300倍。

后來Self等又用刃天青(resazurin)代替其原來放大模式中的四唑鹽，刃天青在黃遞酶的作用下成為發(fā)出熒光的resorufin，然后使用熒光比色計測定得到結果。這種方式的測定敏感性也較原始方法大為提高，每孔內僅含約350個AP分子也可測出。

二、雙酶級聯(lián)放大系統(tǒng)

dual-enzyme cascade雙酶級聯(lián)放大系統(tǒng)又稱酶抑制級聯(lián)放大系統(tǒng)，酯酶抑制劑4—(3—氧—4，4，4—三氟丁基)苯磷駿鹽因其帶有封閉性—P04基團，對酯酶不具抑制活性，但 當其在AP作用下脫—PO4基時，失活的抑制劑即成為具活性的抑制劑，使加入的羧酸酯酶失活，通過顯色反應測定殘留的酯酶活性即可知原始AP的活性，二者 成反比相關。這種放大系統(tǒng)的測定敏感性較普通方法可提高約125倍。

三、酶激活級聯(lián)放大系統(tǒng)

enzymeactivationcascade這亦是一種以AP為標記酶的放大系統(tǒng)。黃素—腺嘌呤二核苷酸磷酸(FADP)在AP的催化下脫磷酸為FAD，F(xiàn)AD則使脫輔基的氨基酸氧化酶轉化為全酶的 氨基酸氧化酶，后者催化晡氨酸生成H2O2，于是在DCHBS，4AAP及HRP存在下，得到有色產物。上述放大系統(tǒng)可測定l{mol/LAP。

此外，催化指示物沉著(catalyzedreporterdeposition，CARD)也是一種多酶級聯(lián)EIA放大系統(tǒng)。HRP氧化生物素或熒光素 標記的酪胺所產生的游離基，可與固相上蛋白的酪氨酸、色氨酸反應而使大量的生物素或熒光素沉著于固相上HRP周圍的區(qū)域內，沉著的生物素可用HRP及6— 半乳糖苷酶或AP標記的鏈霉親合素測定，沉著的熒光素則可用酶標抗熒光素測定。這樣使得一分子HRP轉化為大量的標記物，從而大為改善(約30倍)EIA 的測定敏感性。Diamandis等使用螯合的Eu3+鏈霉親合素—甲狀腺球蛋白試劑替代上述酶標物測定AFP，不但提高了測定敏感性，而且也使背景“噪 聲”較普通方法改善了6～8倍。我們將上述CARD放大系統(tǒng)直接用于HBsAg商品ELISA試劑盒，在不改變商品試劑盒任何成分和操作步驟的情況下，可 將試劑盒的測定敏感性提高約5倍。

四、凝固因子酶級聯(lián)放大系統(tǒng)

脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)可激活鱟血細胞裂解物的凝固級聯(lián)反應。首先LPS使因子C激活為C，后者又激活因子B為B，B使 前凝固酶轉化為凝固酶，凝固酶則催化底物(Boc-Le，u-Gly-Arg-p)產生有色的對硝基苯胺(曠 nitroa·niline，PNA)，A405nm測定。因此，在免疫測定中，如以LPS作為標記物標記抗體，則可通過上述反應使測定敏感性放大，可檢 出10-7～10-11g／m1的IgG和10-7～10-11g／ml的抗IgG，Seki等將上述方法用于雙夾心法檢測HBsAg，敏感性達 10-10～10-12g／ml。

五、免疫復合物轉移兩位點酶免疫試驗

一般來說，在酶免疫測定中，限制測定敏感性的一個重要因素是非特異地結合于固相的標記酶的顯色反應，因其會使背景顯色加深，從而掩蓋了低濃度待測物所致的 特異顯色，解決這個問題提高測定敏感性的一條途徑是將待測物——抗體—酶復合物從固相上洗提至另一個固相，使用一雙標抗體[如生物素和二硝基苯(DNP) 標記的抗體]和一酶標抗體即可達到這個目的，在液相中形成的免疫復合物(雙標抗體：抗原：抗體：酶)捕獲于DNPIgG包被的聚苯烯珠上，洗滌后，使用二 硝基苯—L—賴氨酸將其從固相上取代下來，然后再將上述免疫復合物捕獲于鏈霉親合素包被的聚苯烯珠上，最后進行酶反應顯色測定。Hashida和 shikawa使用該方法測鐵蛋白敏感性達到1zeptomole(1X10-21mol，約600個分子)，較常規(guī)方法提高了30倍。眾多的研究者用該 方法測定抗甲狀腺球蛋白IgC及抗HTLV—1 IgG和抗HIV-1 IgG，敏感性均遠遠地超過常規(guī)方法，取得了良好的效果。

此外，Domingo和Marco等在進行點免疫結合試驗時，以4—氯—1—萘酚作為HRP的底物，反應后得到的不可溶產物因其具有特殊的紫外吸收及熒光 幻滅特征而可在紫外燈下觀察結果。由于沉著于膜上的物質是HRP反應的中間產物，而非可見光下能見到的最終產物，所以可大幅度地提高這種固相免疫測定的敏 感性，較常規(guī)方法約增加100倍。至于酶脂質體放大系統(tǒng)(1iposomeamplificationsystem)，也是一種新型高效的EIA測定放大 系統(tǒng)。

綜上所述，EIA測定放大方式雖然多種多樣，且不斷推陳出新，但研究者的出發(fā)點無非是一方面極力降低影響測定敏感性的非特異顯色，如通過 增加操作步驟而達到上述目的的免疫復合物轉移兩位點酶免疫試驗；另一方面則是通過質量提高的信號，從而達到提高敏感性的目的，如增加反應層次的生物素—親 合素，多酶級聯(lián)等放大系統(tǒng)。但嚴格地講，真正稱得上是EIA測定放大系統(tǒng)的僅限于后者，前者還只能說是一種所謂的超敏感 EIA(uhrasensitive enzyme immunoassay)。至于利用酶反應產物特征改變檢測手段(如發(fā)光或熒光檢測)而使EIA測定敏感性提高，則只不過是依靠儀器開闊了“視野“而已。