乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。全球每年約有1【)()萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌(肝癌)，肝癌患者巾，75以上由HBV所致。我國屬HBV感染地方性流行區(qū)。根據(jù)2006年全國乙型肝炎流行病學調(diào)查，我國現(xiàn)有的慢性HBV感染者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例，每年因HBV導致的肝硬化和肝癌死亡約3o余萬例，新發(fā)乙型肝炎病例約50～1O0萬例。乙肝防治是當前及今后相當長時間內(nèi)要面臨的重要任務(wù)。

HBV是血源傳播性疾病，主要經(jīng)血(如不安全注射等)、母嬰及性接觸傳播。乙型肝炎病毒屬嗜肝DNA病毒科(hepadnavdae)，基因組長約3．2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。急性乙型肝炎病毒感染HBVDNA存在先陽性后消失的發(fā)展過程，慢性乙型肝炎病毒感染的自然史一般可分為4個期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活動或低(非)復制期和再活動期，其中免疫耐受期HBVDNA滴度較高(3v于20000IU·mU)，免疫清除期表現(xiàn)為血清HBVDNA滴度大于2000IU·mL，但一般低于免疫耐受期。非活動或低(非)復制期可表現(xiàn)為HBVDNA持續(xù)低于最低檢測限。部分再活動期患者表現(xiàn)為HBVDNA活動性復制。但并不是所有HBV感染者都經(jīng)歷以上四期]。

HBV已發(fā)現(xiàn)有9個基因型(A～I)，每個基因型又可分為不同亞型，且存在基因型之間的重組現(xiàn)象。我國已發(fā)現(xiàn)A、B、C、D基因型，中東部地區(qū)以B、c基因型占優(yōu)勢，其中北方地區(qū)(長江以北)主要為C2亞型；南方大部分地區(qū)流行株為B2、C2、C1亞型，并有少部分D基因型；西部地區(qū)尤其是新疆地區(qū)以D基因型為主，西部藏族居民中以C／D重組基因型為主lA型和B1亞型罕見乙型肝炎的實驗室檢查包括生物化學檢測(如血清ALT和AST、血清膽紅素、膽堿酯酶等)、HBV血清學檢測(乙肝五項)以及HBVDNA、基因型和突變檢測。其中HBVDNA定量檢測可反映病毒復制水平，用于乙肝輔助診斷的指標之一，還可通過對血中HBVDNA水平的監(jiān)測，用于HBV感染的診斷、治療適應(yīng)癥的選擇及抗病毒療效的判斷]

本文所指乙肝病毒核酸定量檢測試劑是指利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)方法，以乙肝病毒基因序列為檢測目的，對人血清、血漿中的乙肝病毒DNA進行體外定量檢測的試劑。本文結(jié)合現(xiàn)行法規(guī)及該試劑自身特點詳述了其性能評價的要點，為試劑研發(fā)和注冊申報提供參考。

1各級標準品的建立

采用滅活病毒的血清／血漿建立標準品，通過逐級標化，建立校準品和質(zhì)控品。制備的企業(yè)標準品、二級標準品、用于制備商品化校準品的儲備液以及不同基因型的陽性樣本均應(yīng)能夠溯源至國際標準品／國家標準品。逐級標化過程一般包括以國際標準品／國家標準品為校準品建立標準曲線對企業(yè)標準品進行賦值，以賦值后企業(yè)標準品為校準品對企業(yè)二級標準品進行賦值，然后逐級對制備商品化校準品的儲備液以及質(zhì)控品進行賦值，建立完整的溯源鏈。

2分析性能研究的主要內(nèi)容

2．1核酸提取方法的提取效率驗證

臨床標本中可能含有各種PCR抑制物，因此，對于DNA提取試劑的選擇，除最大量釋放出目的DNA外，還應(yīng)包含核酸純化步驟，盡可能去除PCR抑制物及干擾物質(zhì)。應(yīng)對核酸提取純化方法的回收率進行驗證，或通過檢測已賦值樣本的相對回收率對提取效果進行考察，同時考察前處理方法與后續(xù)步驟的適用性lg。

2．2靈敏度研究

靈敏度分析包含兩方面的內(nèi)容：最低檢出量和定量限。最低檢出量為具有95以上陽性檢出率的病毒水平，定量限為能夠符合準確度要求的最低病毒水平。

使用國際標準品／國家標準品進行梯度稀釋并多次檢測確定最低檢出限。將多次(至少1O次)鋇0量的符合試劑準確度要求的最低病毒水平作為最低定量限。應(yīng)用最低檢出限或接近最低檢出限的病毒濃度的不同基因型(至少包括國內(nèi)基因型中的B、C、D型)對最低檢出限和定量限進行驗證。

2．3線性范圍研究

線性范圍確定的研究應(yīng)使用高值臨床樣本(由可溯源至國家標準品／國際標準品的方法定量)進行梯度稀釋，稀釋劑應(yīng)使用經(jīng)確認為陰性的混合人血清或血漿，應(yīng)包含不少于9個濃度(應(yīng)包含接近最低檢測限的臨界值濃度)，使用至少3個批次的試劑進行試驗。通過評價一定范圍內(nèi)的線性關(guān)系及各水平的準確度確定該方法的線性范圍。

2．4準確度研究

對測量準確度的評價應(yīng)進行與國家標準品(和／或國際標準品)的比對研究、回收試驗、方法學比對等試驗研究。

2．4．1與國家(國際)標準品的比對研究

使用國家(國際)標準品進行驗證，考察與相應(yīng)標準品檢測結(jié)果的符合情況。

2．4．2回收試驗

用于評估定量檢測方法準確測定加入純分析物的能力，結(jié)果用回收率表示?；厥赵囼瀾?yīng)對檢測范圍內(nèi)的高中低值標準品進行檢測，計算各水平的相對回收率。

2．4．3與同類試劑的比對研究

采用國內(nèi)或國際普遍認為性能較好的同類試劑作為比對試劑，被考核試劑與比對試劑同時檢測一批病人樣品，從測定結(jié)果間的相關(guān)性了解試劑間的一致情況。

2．5精密度研究

測量精密度的前提是必須保證研究的科學合理性。應(yīng)對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異系數(shù)的范圍等。

2．5．1對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除試劑(包括提取組分和PcR組分)本身的影響外，還應(yīng)對PCR分析儀、操作者、地點等要素進行相關(guān)的驗證。

2．5．2合理的精密度評價周期，例如：為期至少2O天的連續(xù)檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)／批間、日內(nèi)／日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，應(yīng)選擇不同的實驗試進行重復試驗以對室間精密度進行評價。

2．5．3用于精密度評價的質(zhì)控品應(yīng)至少包括四個水平

2．5．3．1陰性質(zhì)控品：不含HBVDNA的質(zhì)控品，不得檢出陽性(72≥2o)。

2．5．3．2臨界陽性質(zhì)控品：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率應(yīng)高于959／6(≥2o)。

2．5．3．3弱陽性質(zhì)控品：待測物濃度呈弱陽性(高于定量限濃度1個數(shù)量級)，陽性檢出率為100％且變異系數(shù)(CV)符合標準要求(n≥20)。

2．s．3．4強陽性質(zhì)控品：待測物濃度呈中度至強陽性，陽性檢…率為100且變異系數(shù)(CV)符合標準要求(”≥2O)。

2．6HBV不同基因型的覆蓋

應(yīng)對乙肝病毒不同基因型(至少包括B、C、D型)進行檢測，重點考察各基因型病毒樣本的最低檢測限、準確性及精密度指標；每個基因型的病毒樣本稀釋成至少3個濃度水平，對每水平樣本進行重復測定。考察每種基因型樣本的準確度和精密度。

2．7分析特異性

2．7．1交叉反應(yīng)

2．7．1．1用于乙肝病毒核酸檢測試劑交叉反應(yīng)驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀以及臨床較為常見。如人巨細胞病毒、E-B病毒、人類免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、梅毒、人類皰疹病毒6型、白色念珠菌(CA)、單純皰疹病毒2型、單純皰疹病毒1型、甲型流感病毒、痤瘡丙酸桿菌(PA)、金黃色葡萄球菌(SA)等。

2．7．1．2建議在病毒和細菌感染的醫(yī)學相關(guān)水平進行交叉反應(yīng)的驗證。通常，細菌感染的水平為10。cfu·mU或更高，病毒為10pfu·1hE-或更高。

2．7．2干擾物質(zhì)

2．7．2．1潛在的干擾物質(zhì)主要包括：內(nèi)源性物質(zhì)(如人白蛋白、抗核抗體、游離血紅蛋白、甘油三酯、自身抗體、膽紅素、總IgG等)和常用的治療藥物如普通IFNa(2a、2b和lb)和聚乙二醇干擾素(2a和2b)[PegIFNc~(2a和2b)]、拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定等。

2．7．2．2使用醫(yī)學相關(guān)水平的干擾物濃度進行驗證，建議在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(“最差條件”)條件下進行評價。對于常見藥物干擾試驗，建議參照相應(yīng)藥物藥代動力學研究確定的治療藥物濃度添加相應(yīng)藥物進行干擾驗證。

2．7．2．3建議在病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質(zhì)的干擾影響進行檢測。

2．8溯源性

使用國家標準品／國際標準品為定標品，應(yīng)用多臺儀器對企業(yè)一級定標品進行定標，以下逐級對企業(yè)二級標準品、定標儲備液、陽性參考品(質(zhì)控)進行定標。

2．9應(yīng)注意的其他問題

對于適用多個機型的產(chǎn)品，應(yīng)對所有型號儀器分別進行性能評估。如適用于不同樣本類型，應(yīng)提交對不同樣本類型一致性的驗證，包括不同抗凝齊、采血管的驗證。

對試劑分析性能的充分驗證是保證試劑臨床應(yīng)用靈敏、準確、特異的前提，是了解試劑性能的必經(jīng)步驟，因此大量的試驗、多批次的驗證是必要的。對于不同試劑，其分析性能研究方法應(yīng)根據(jù)試劑本身特性進行設(shè)計，本文闡述的乙肝核酸定量檢測試劑的性能評價應(yīng)首先考慮病毒本身的特性及試劑的臨床用途，因此定量是否靈敏、是否準確精密、是否能夠涵蓋常見基因型、是否具備良好的特異性以及是否易被常見干擾物質(zhì)影響等方面成為其分析性能考察的重點。