免疫膠體金技術(shù)((Immunecolloidalgoldtech2nique,ICG))是一種常見的標(biāo)記技術(shù),它是以膠體金為標(biāo)記物,利用特異性抗原抗體反應(yīng),在光鏡電鏡下對抗原或抗體物質(zhì)進(jìn)行定位、定性乃至定量研究的標(biāo)記技術(shù),是繼三大標(biāo)記技術(shù)(熒光素、放射性同位素和酶)后發(fā)展起來的固相標(biāo)記免疫測定技術(shù)。膠體金最早由法拉第發(fā)現(xiàn)于1857年,他用還原法從氯金酸水溶液中制備膠體金,并發(fā)現(xiàn)在其中加入少量電解質(zhì)后,可使膠體金由紅色變?yōu)樗{(lán)色,最終凝集成無色,而加入明膠或其他大分子物質(zhì)便可阻止這種變化,他的重大發(fā)現(xiàn)奠定了膠體金制備和應(yīng)用的科學(xué)基礎(chǔ)。1971年Faulk和Taylon[1]首次用兔抗沙門氏菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合、制備成金標(biāo)抗體檢測細(xì)菌表面抗原的分布。1974年,Romano等[2]用膠體金標(biāo)記抗球蛋白抗體,建立間接免疫金染色法。此后,膠體金作為一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)得到很快發(fā)展。1980年,Geoghegan[3]應(yīng)用免疫金技術(shù)檢測B淋巴細(xì)胞表面抗原,建立了光鏡水平的免疫金技術(shù)(immunogoldstaining,IGS)。Danscher[4]在此基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展了用銀顯影液增強光鏡金顆粒可見性的免疫金染色法(im2munogoldstaining,IGSS)。Holgate[5]又對上法加以改進(jìn),將免疫金染色與銀顯影技術(shù)相結(jié)合,建立免疫金銀染色法(immunogoldsilverstaining,IGSS)。近年來,研究人員根據(jù)膠體金的物化性質(zhì)進(jìn)一步拓展了基于膠體金標(biāo)記的生物檢測技術(shù)及膠體金在其他生物學(xué)方面的應(yīng)用。目前已廣泛應(yīng)用于被動凝集試驗、光鏡染色、免疫印跡、流式細(xì)胞術(shù)、液相免疫測定、斑點金免疫滲濾及免疫層析等,其中在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用主要是免疫層析法(immuno2chromato2graphicassay,ICA)和快速免疫金滲濾法(Dot2immu2nogoldfiltrationassay,DIGFA)。免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法,因其快速簡便、特異敏感、穩(wěn)定性強、不需要特殊設(shè)備和試劑、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點已在人醫(yī)的臨床檢驗和其它領(lǐng)域取得廣泛的應(yīng)用,如妊娠試驗、傳染病病原抗體的檢測、蛋白質(zhì)的檢測和藥物測定等,該技術(shù)在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用也日益廣泛。

1膠體金技術(shù)的基本原理

氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下,可聚合成一定大小的金顆粒,形成帶負(fù)電的疏水膠溶液,由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體體系,故稱膠體金。膠體金顆粒散在,直徑從幾納米到幾十納米不等,由于不同直徑的膠體金的光散射各異,所以其溶膠顏色的深淺相應(yīng)發(fā)生顯著的變化,這就是膠體金用于被動凝集試驗的基礎(chǔ)。膠體金標(biāo)記實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程,吸附機理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷,與蛋白質(zhì)的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒,這種球形的粒子對蛋白質(zhì)有很強的吸附功能,可以與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素和激素等多種物質(zhì)非共價結(jié)合,從而使其成為免疫反應(yīng)的優(yōu)良標(biāo)記物。免疫膠體金顆粒具有高電子高密度的特性,在顯微鏡下金標(biāo)蛋白結(jié)合處,可見黑褐色顆粒,當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時,肉眼可見紅色或粉紅色斑點,因而可用于定性或半定量的快速免疫檢測,而且金顆粒還可催化銀離子還原成金屬銀,因此在膠體金免疫測定時加入銀染色液,能放大反應(yīng)信號,大大增加測定的靈敏度。

2膠體金的制備及膠體金的標(biāo)記

2.1膠體金的制備

膠體金的制備一般采用還原法,常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。其原理是利用還原劑將氯金酸溶液中的金離子還原成金原子,根據(jù)還原劑類型以及還原作用的強弱,可以制備5-150nm不等的膠體金,一般還原劑用量越大制備的膠體金顆粒越小。最常用的制備方法為檸檬酸鈉還原法,操作過程如下:取100mL0.01%的氯金酸(HAuCl4)水溶液用水浴磁力攪拌鍋加熱至沸騰,在磁力攪拌器以一定轉(zhuǎn)速不斷攪拌下迅速加入所需用量的1%檸檬酸三鈉水溶液,繼續(xù)攪拌加熱約15min至溶液顏色穩(wěn)定不變。膠體金制備過程要求所用玻璃容器必須絕對清潔,玻璃表面少量的污染會干擾膠體金顆粒的生成,產(chǎn)生凝集顆粒,因此玻璃器皿用前要經(jīng)過泡酸、超聲洗滌處理,并用蒸餾水、超純水依次沖洗浸泡,然后烘干備用。

2.2膠體金的標(biāo)記

由于膠體金顆粒在電解質(zhì)中不穩(wěn)定,制備后應(yīng)立即用大分子(如蛋白質(zhì))進(jìn)行標(biāo)記。膠體金顆粒對蛋白質(zhì)的吸附作用取決于pH值。在pH值=pI值時,蛋白質(zhì)溶解度最小,水化程度最小,最容易吸附到疏水的金顆粒表面,但在實際操作中,一般膠體金溶液的pH值調(diào)到稍高于標(biāo)記用蛋白質(zhì)的PI值,這樣蛋白質(zhì)帶正電,結(jié)合更穩(wěn)定,可用0.1mol/LK2CO3或0.1mol/LHCL調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至選定值,但通常最適反應(yīng)pH往往需經(jīng)多次試驗才能確定,在調(diào)節(jié)膠體金的pH值時,膠體金會阻塞pH計的電極,因此可用普通PH試紙先調(diào)到目標(biāo)pH值附近再換用精密pH試紙調(diào)節(jié)[6],也可以用膠體金專業(yè)pH計調(diào)節(jié)pH。標(biāo)記應(yīng)在磁力攪拌下,逐滴加入待標(biāo)記蛋白溶液,混勻30min后繼續(xù)在磁力攪拌下加入10%BSA,使其終濃度為0.5%,攪拌混勻15min,再加入5%PEG20000至終濃度為0.1%,再持續(xù)攪拌混勻15min,最后4靜置過夜。由于鹽類成分能影響膠體金對蛋白質(zhì)的吸附,并可使膠體金聚沉,因此待標(biāo)記蛋白質(zhì)溶液若含有較高的離子濃度,應(yīng)在標(biāo)記前先對低離子強度的雙蒸水透析去鹽,并通過離心及微孔濾膜過濾以除去細(xì)小顆粒,然后通過系列稀釋法找出能使膠體金穩(wěn)定的待標(biāo)記蛋白的最低濃度,這一濃度再加10%即為最佳標(biāo)記蛋白量。標(biāo)記好的膠體金還應(yīng)加入終濃度為0.05%-011%的PEG6000或PEG20000作為穩(wěn)定劑[7]。

多種蛋白質(zhì)、葡聚糖、PEG2000、明膠等均為良好的高分子穩(wěn)定劑,PEG和BSA是最常用的穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑有兩大作用,一為保護膠體金的穩(wěn)定性,使之便于長期保存;二為防止或減少免疫金復(fù)合物的非特異性吸附反應(yīng)。穩(wěn)定劑的合理選擇十分重要,不適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑有時也會導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。

2.3膠體金標(biāo)記后的純化

標(biāo)記好的膠體金中往往還含有未結(jié)合的蛋白質(zhì)、未充分標(biāo)記的膠體金以及標(biāo)記過程終形成的各種聚合物。因此標(biāo)記好的膠體金還需經(jīng)過純化才能使用,一般純化方法有離心法和凝膠過濾法等。采用離心法時,一般顆粒10nm以上的膠體金可高速離心,顆粒小于10nm的膠體金要用超速離心,在4離心15min至1h不等,棄上清,沉淀用原體積的0.02mol/LTBSpH8.2(含1%BSA,0.05%疊氮鈉)溶解,重復(fù)離心2-3次,沉淀溶于原體積的1/10PBS溶液中,4保存?zhèn)溆?。凝膠過濾法為純化免疫膠體金的最好方法,過濾的膠體金顆粒比較均勻,不容易凝集,而離心法轉(zhuǎn)速高,時間長,膠體金顆粒沉淀后容易凝集,用凝膠過濾法克服了這一弱點。將濃縮好的免疫膠體金先以1500r/min離心除去大的聚合物,取上清液過柱?？捎肧ephacryls2400或Sepharose24B(或6B)裝柱,0.02mol/LTBSpH8.2平衡和洗脫。

3免疫膠體金技術(shù)的應(yīng)用

3.1免疫膠體金技術(shù)在電鏡上的應(yīng)用

20世紀(jì)人們將電鏡技術(shù)與免疫學(xué)方法相結(jié)合,逐步形成了免疫電鏡檢查術(shù)。隨著膠體金標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展,該技術(shù)逐漸被引入到免疫電鏡技術(shù)中來。膠體金是用于免疫電鏡的最佳標(biāo)記物,因為它呈球形,非常致密,在電鏡下具有強烈反差,容易追蹤在電鏡下檢出抗原抗體復(fù)合物。膠體金免疫電鏡技術(shù)已成為目前最常用的免疫細(xì)胞化學(xué)方法之一,它具有靈敏度高、特異性強、定位精確等優(yōu)點,同時它還可以對抗原進(jìn)行定性、定量、定位的分析與觀察。應(yīng)用免疫金雙重或多重標(biāo)記法,可將形態(tài)、功能和結(jié)構(gòu)的研究融為一體,有助于了解同一組織或細(xì)胞內(nèi)不同分子間的相互關(guān)系,以及它們的合成、分泌、轉(zhuǎn)運等代謝過程。薛擁志等[8]通過直接電鏡、免疫電鏡、膠體金免疫電鏡技術(shù)等3種不同電鏡技術(shù)觀察新城疫病毒,結(jié)果證明用膠體金免疫電鏡技術(shù)觀察時由于視野中病毒粒子周圍有膠體金顆粒附著,金顆粒呈現(xiàn)強烈的反差,很容易找到病毒粒子,免疫金標(biāo)記可以顯著的提高樣品的病毒檢出率。劉霓紅等[9]建立用免疫膠體金電鏡檢測技術(shù)檢測犬細(xì)小病毒,證明免疫膠體金電鏡技術(shù)有助于提高CPV檢出率和特異性。

3.2免疫膠體金技術(shù)在生物傳感器上的應(yīng)用

近年來金標(biāo)記被引入生物傳感器中的應(yīng)用研究增多。已有許多致力于信號放大免疫傳感器的研制報道,其中應(yīng)用較多的是通過阻抗信號的變化來檢測抗原(抗體)的含量。Kim等[10]通過交流電導(dǎo)法檢測了在叉指電極上的金標(biāo)記的免疫凝集,從而實現(xiàn)了膠體金免疫層析試驗的電化學(xué)檢測方法,并且通過在膠體金上包被導(dǎo)電聚合物聚苯,提高電導(dǎo)法測定金標(biāo)免疫反應(yīng)的靈敏度。Brainina等[11]在標(biāo)記膠體金標(biāo)記A蛋白的基礎(chǔ)上,制作了診斷森林腦炎的電化學(xué)免疫傳感器,檢測血清中的森林腦炎抗體及其濃度。Tang等[12]基于鉑金電極修飾的膠體金提高了生物傳感器檢測HABS表面抗體敏感性和穩(wěn)定性。Kitano等[13]用基于膠體金表面等離子共振效應(yīng)的電感受器測定胃蛋白酶的親和常數(shù)。

3.3免疫膠體金快速診斷技術(shù)

免疫膠體金快速診斷技術(shù),由于方便快捷、特異敏感、穩(wěn)定性強、不需要特殊設(shè)備和試劑、結(jié)果判斷直觀,并可保存試驗結(jié)果等優(yōu)點,已在醫(yī)學(xué)、動植物檢疫、食品安全監(jiān)督各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。目前,醫(yī)學(xué)檢驗中應(yīng)用的免疫膠體金快速檢測技術(shù)主要有快速斑點免疫金滲濾法(DIGFA)和膠體金免疫層析法(GICA)兩種方法。這兩種方法都是以微孔濾膜為載體,包被已知抗原或抗體,加入待檢標(biāo)本后,經(jīng)濾膜的毛細(xì)管作用或滲濾作用使標(biāo)本中的抗原或抗體與膜上包被的抗體或抗原結(jié)合,再用膠體金標(biāo)記物與之反應(yīng)形成紅色可見結(jié)果從而達(dá)到檢測目的。

3.3.1斑點免疫金滲濾法斑點免疫滲濾技術(shù)是20世紀(jì)80年代中期從固相酶免疫測定技術(shù)發(fā)展起來的較簡便的固相標(biāo)記免疫測定方法,該技術(shù)主要應(yīng)用微孔濾膜(NC膜)作載體的免疫檢測技術(shù),先將抗原或抗體點于NC膜上,封閉后加待測樣品,洗滌后用膠體金探針檢測相應(yīng)的抗原或抗體。通過金顆粒來放大免疫反應(yīng)系統(tǒng),使反應(yīng)結(jié)果在固相載體NC膜上顯示出來。Moeremans等用此法研究表明免疫膠體金斑點滲濾法比間接過氧化物酶法更敏感一些。

曹三杰等[14]建立了斑點免疫金染色法檢測PPV抗體的方法,對豬細(xì)小病毒病抗體最小檢出量為1.008×10-10g/mL,并且不同豬布魯氏菌病、豬偽狂犬病、豬衣原體病、豬口蹄疫、豬瘟及豬弓形體病等的陽性血清出現(xiàn)交叉反應(yīng)?？追钡碌萚15]通過用膠體金標(biāo)記SPA建立檢測豬瘟抗體水平的斑點免疫金滲濾法檢測試紙盒與目前豬瘟的常規(guī)檢測方法dot2ELISA法和間接血凝試驗同時對200份豬血清進(jìn)行豬瘟抗體檢測比較,符合率達(dá)9814%和9819%,說明該法特異、靈敏。王祥等[16]建立了特異性地檢測豬流行性乙型腦炎病毒抗體的斑點金免疫滲濾測定法,與血凝抑制試驗(HI)對比檢測了54份豬血清臨床樣本,兩法的陽性符合率為7114%、陰性符合率為6515%、總符合率為8114%。孔繁德等[17]應(yīng)用膠體金標(biāo)記純化的兔抗沙門氏菌抗體21,SPA包被硝酸纖維素膜作對照點,建立直接檢測沙門菌的斑點免疫金滲濾法(DIGFA)檢測試紙盒最低檢測量為415×106CFU/mL,將該法與國標(biāo)法檢測效果比較,符合率達(dá)100%。朱明東等[18]對布魯氏菌病監(jiān)控地區(qū)重點人群和不同職業(yè)人群采用斑點金免疫滲濾法(DIGFA)和試管凝集試驗(STA)檢測布魯氏菌病抗體結(jié)果表明重點人群兩種方法檢測抗體陽性符合率為96166%,陰性符合率為99192%;不同職業(yè)人群兩種方法檢測陽性符合率為96136%,陰性符合率為99192%。該法敏感性和特異性與ELISA法具有良好的相符性,且具有反應(yīng)快、操作簡便、結(jié)果易于觀察等優(yōu)點,標(biāo)記好的診斷試劑盒可以長期保存,隨時使用,更適合于基層推廣應(yīng)用。3.3.2膠體金免疫層析法膠體金免疫層析技術(shù)是20世紀(jì)90年代初在免疫滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡易快速的檢測技術(shù),由Beggs等[19]最先用于人絨毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadothphin,HCG)的測定。近年來該技術(shù)發(fā)展迅速,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是醫(yī)學(xué)檢驗中得到了廣泛應(yīng)用。

膠體金快速診斷試紙條主要是將特異性的抗原或抗體以條帶狀包被在NC膜的檢測線T上,膠體金標(biāo)記的抗原或抗體吸附在結(jié)合墊上,當(dāng)待測樣品加到試紙條一端的加樣孔上后,通過毛細(xì)作用向前移動,溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記的抗原或抗體,再移動至包被的抗原或抗體的檢測線處,如果樣品中含有相應(yīng)的抗體或抗原,包被在檢測線上的抗原或抗體和膠體金標(biāo)記物與樣品中的相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合,形成免疫復(fù)合物,膠體金富集在檢測線處形成一條可見的紫紅色線。如果待檢血清中沒有相應(yīng)抗體,膠體金標(biāo)記物將不會與包被在檢測線上的抗原或抗體結(jié)合,膠體金不會富集,檢測線上不會出現(xiàn)紫紅色色線。當(dāng)樣品與溶化了的膠體金標(biāo)記物繼續(xù)往上移動至對照線時,就與包被在對照線處的特異性抗體或抗原結(jié)合,在對照線上形成免疫復(fù)合物,出現(xiàn)一條膠體金富集的紫紅色色線。試紙條如圖1所示。

金顏輝等[20]建立的豬瘟金標(biāo)免疫層析試紙測試30份標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和18份標(biāo)準(zhǔn)陰性血清,結(jié)果陽性、陰性符合率100%。與ELISA試劑、dot2ELISA試劑及正向間接血凝進(jìn)行比校試驗,檢測血清樣品205份,結(jié)果陽性率ELISA為86.8%,金標(biāo)層析法為85.4%,dot2ELISA為81.5%,正向間接血凝為58.5%。張長弓等[21]建立了檢測口蹄疫(O型)抗體水平的免疫膠體金快速檢測試紙法,應(yīng)用該法與口蹄疫正向間接血凝抗原法對300份豬、雞、鴨、牛、羊等血液或血清進(jìn)行口蹄疫抗體水平檢測試驗,符合率達(dá)100%。方瑩等[22]研制的RRRS抗體免疫金標(biāo)試紙,用該試紙與PRRS2ELISA試劑盒分別對30份豬血清及血液樣品進(jìn)行抗體水平檢測,結(jié)果完全一致。黃印堯等[23]建立了檢測豬偽狂犬病抗體水平免疫膠體金快速檢測試紙法,用該法與美國Idexx公司的豬偽狂犬病ELISA試劑盒,同時對16份豬血液或血清進(jìn)行抗體水平檢測,符合率達(dá)100%。同時使用金標(biāo)法對100份豬血液和對應(yīng)血清進(jìn)行檢測,結(jié)果也相同。王金春[24]建立的膠體金免疫層析法檢測乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)試紙條只與HBsAg有特異性反應(yīng),與乙型肝炎病毒核心抗原、e抗原等無交叉反應(yīng),檢測中國藥品生物制品檢定所HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品,靈敏度可達(dá)1ng/mL。用GICA與酶免疫法比較檢測了395份不同血清標(biāo)本中HBsAg,兩法符合率為99%。李月越等[25]用膠體金免疫層析法(GICA)和間接免疫熒光法(IFA)對同一份標(biāo)本甲型及乙型流感病毒進(jìn)行檢測,結(jié)果得到較好的一致性。這種檢測技術(shù)具有操作簡單快速,特異性、敏感性好,可單份測定,結(jié)果直觀,且可保存試驗結(jié)果,無須特殊儀器等優(yōu)點,適合于廣大基層單位、醫(yī)院、野外作業(yè)人員以及大批量時間緊的檢測和大面積普查等,因此該技術(shù)具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。

4免疫膠體金技術(shù)的優(yōu)點

膠體金制備容易,價格低廉。免疫金標(biāo)記不僅可用于常規(guī)光鏡,而且還可用于熒光顯微鏡。光鏡應(yīng)用的IGSS法是迄今最敏感的免疫組化方法。由于金顆粒具有很強的激發(fā)電子能力,還可用于掃描電鏡和x射線衍射分析等?？梢詷?biāo)記多種生物大分子物質(zhì),如抗體葡萄球菌蛋白A(SPA)、凝集素、多糖、多肽及其它蛋白質(zhì)而不影響其生物活性。免疫膠體金對組織細(xì)胞的非特異性吸附作用小,故具有較高的特異性。膠體金是高電子密度顆粒性標(biāo)記物,電鏡下分辨率高,對超微結(jié)構(gòu)遮蓋少,并易與其他顆粒性結(jié)構(gòu)相區(qū)別,具有較精確的定位能力。金顆粒大小可以控制,顆粒均勻,可進(jìn)行雙重和多重標(biāo)記,即用不同大小的金顆粒分別標(biāo)記不同的抗體,實現(xiàn)在同一張切片上觀察兩種以上的抗原,也可以和其他標(biāo)記物配合進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記。由于膠體金本身有鮮艷的橘紅色,可用光鏡或肉眼觀察試驗結(jié)果,也可用分光光度計測定光吸收,進(jìn)行定量分析?？稍谇衅煌曇爸懈鶕?jù)金顆粒的數(shù)目來半定量抗原。應(yīng)用于快速檢測技術(shù)還具有操作簡單快速,特異性、敏感性好,可單份測定,結(jié)果直觀,且可保存試驗結(jié)果,無須特殊儀器等優(yōu)點。

5前景與展望

免疫膠體金技術(shù)是繼3大標(biāo)記技術(shù)(熒光素、放射性同位素和酶)后發(fā)展起來的固相標(biāo)記免疫測定技術(shù)。免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物,應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。近年來,該技術(shù)在醫(yī)學(xué)、動植物檢疫、食品安全監(jiān)督等各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。免疫膠體金快速檢測技術(shù)的靈敏性與ELISA基本相近,許多試驗的敏感度都可達(dá)到1ng/mL或更低水平[26,27],但是有些試驗往往不能達(dá)到如此的敏感度,靈敏度的提高無疑會拓寬膠體金免疫檢測技術(shù)的檢測范圍。進(jìn)一步提高免疫膠體金檢測的敏感性、特異性、實現(xiàn)多元檢測、實現(xiàn)定量或半定量檢測將是未來膠體金技術(shù)的發(fā)展方向。

5.1進(jìn)一步提高檢測的靈敏度

采用信號放大系統(tǒng)如生物素-親和素系統(tǒng)是提高檢測靈敏度的有效方法之一。生物素-親和素系統(tǒng)(BAS)是一種具有高親和力、靈敏度高、特異性強和穩(wěn)定性好等優(yōu)點的信號放大標(biāo)記技術(shù),研究證明生物素與親和素依靠接觸表面均一的多層膜來維系其穩(wěn)定的結(jié)合。BAS應(yīng)用于膠體金技術(shù),其原理為帶正電荷的鏈霉親和素標(biāo)記的帶負(fù)電荷的膠體金顆粒能與生物素緊密結(jié)合,使檢測信號在只有膠體金標(biāo)記或只有BAS標(biāo)記的基礎(chǔ)上得到擴大[28]。殷涌光等[29]引入了生物素-親和素系統(tǒng),將膠體金復(fù)合的抗體作為夾心法的二次綜合利用夾心式方法、膠體金復(fù)合的抗體和延長微生物與抗體的結(jié)合時間等辦法顯著提高了檢測精度,將SPR生物傳感器對大腸桿菌濃度的檢測范圍從106CFU/mL提高到了101CFU/mL。

5.2實現(xiàn)多元檢測

可采用在同一膜上作多種項目測定和多項目的組合測定兩種方式。一次檢測可同時得到一組結(jié)果,這對于檢測某些具有聯(lián)檢意義的物質(zhì)具有很大的應(yīng)用價值。Buechler等[30]用一膜包被多元抗體帶的(包括陽性對照和陰性對照)的方法研制出可同時檢測7種藥物的免疫層析試紙條,能對乙型肝炎表面抗原、艾滋病病毒抗體和抗原,及丙型肝炎抗體等進(jìn)行同時檢測,對篩選獻(xiàn)血者提供了很大便利。王榮等[31]建立的雙重斑點免疫金滲濾法能同時檢測HC和PRRS,對于當(dāng)前豬病以混合感染為主的趨勢,該法能快速、準(zhǔn)確、特異的同時檢測豬溫和豬繁殖與呼吸綜合征從而提高豬病的診斷效率。

5.3實現(xiàn)半定量或定量檢測

定性檢測的結(jié)果只有陽性和陰性,只能用于檢測臨床樣本中是否有特定的生物成分存在,然而很多其它檢測需要定量,例如,監(jiān)控臨床指標(biāo)的變化或確定特定分析物的相對或絕對濃度。目前擁有膠體金定量檢測的方法包括根據(jù)顯色強度應(yīng)用簡單儀器進(jìn)行定量,如應(yīng)用反射的光密度計測量顯色帶或斑點的顏色強度,將顏色強度轉(zhuǎn)化為數(shù)字指標(biāo),以實現(xiàn)定量的檢測。Helm等[32]用TROPT快速檢測儀能快速準(zhǔn)確的顯示肌鈣蛋白2T(cTnT)的量,精度到0.2μg/L,已經(jīng)成為患者床旁診斷急性心肌梗死的快速靈敏方法。儲迅濤等[33]建立了膠體金免疫凝集抑制試驗以定量測定尿液中的微量白蛋白。特異性免疫反應(yīng)發(fā)生可導(dǎo)致金溶膠疑集,不同大小的金顆粒對光的反射不同,呈現(xiàn)不同顏色,可用比色測定來定量特異性免疫反應(yīng)發(fā)生的程度。該法與全自動蛋白質(zhì)分析儀上散射速率比濁法的結(jié)果進(jìn)行了比較,兩種方法的相關(guān)性達(dá)到99.5%。此外,還可通過應(yīng)用不同靈敏度受體固定量的方式,觀察各自顯色情況,將待測物含量確定于某一濃度區(qū)間,以實現(xiàn)半定量檢測。Cho等[34]改進(jìn)了膠體金免疫層析分析體系,建立了半定量化的條形碼分析模型,能夠顯示分析物的濃度范圍(如尿中人血清白蛋白),進(jìn)行半定量化檢測。

總之,免疫膠體金技術(shù)是繼3大標(biāo)記技術(shù)之后又一較為成熟且已得到廣泛應(yīng)用的免疫標(biāo)記技術(shù)。作為一種檢測技術(shù)與其他方法相比,如ELISA,RIA等,在許多方面具有無可比擬的優(yōu)勢,該技術(shù)操作簡便、快速、特異,適用于廣大基層單位并能在現(xiàn)場作檢測和診斷。在今后的研究中,免疫膠體金技術(shù)將更進(jìn)一步顯示其巨大的優(yōu)越性,同時也將在更廣闊的領(lǐng)域內(nèi)發(fā)揮其作用。