來源：石頭道科普
蛋白質是生命功能的最終執(zhí)行者，也是臨床診斷、疾病分型、藥物篩選等生物醫(yī)學相關領域重要、應用廣的檢測對象。免疫檢測一直以來在蛋白質檢測中占據著主導地位。免疫檢測技術如ELISA，CLIA等的靈敏度一般只能達到pg/mL水平。然而，在疾病早期，精確檢測這些超低豐度蛋白又對預判疾病的發(fā)生與轉歸有著重大意義，伴隨著大健康產業(yè)和精準醫(yī)學的發(fā)展，傳統方法的技術瓶頸與巨大市場需求之間的矛盾日趨凸顯。本期推送主要介紹Digital ELISA的技術原理及產業(yè)化情況。
Digital PCR是目前絕對定量PCR的主要技術方式，通過對樣品的微滴化處理，使每個單元包含沒有、一個或者多個拷貝的目標分子，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析。由于不需要對其擴增曲線進行監(jiān)控，不受擴增效率影響，擴增結束后通過直接計數或泊松分布公式來計算每個反應單元的平均濃度達到絕對定量的目的。
同樣的理念目前已用于開發(fā)其它數字化檢測技術，如Digital ELISA、Digital LAMP和Digital RPA。為了實現更低濃度蛋白質檢測，Quanterix采用類似于Digital PCR的方式開發(fā)了Digital ELISA。它們稱這個技術為Simoa（Single-molecule Array），Simoa技術靈敏度比ELISA高1000倍以上，它的出現將蛋白質檢測技術直接帶入到單分子、數字化檢測時代，成為fg級超低豐度蛋白質檢測領域的優(yōu)勢技術。
什么是Digital ELISA
Digital ELISA，也稱為Simoa技術，與傳統免疫試驗主要區(qū)別在于Simoa能夠在飛升大小的孔中捕獲單個分子，允許單個磁珠信號的數字化讀取。Simoa最早的報道源自于2010年naure biotechnology的報道。本質上SIMOA的設計理念和Digital PCR很像。
Simoa所采用的Digital ELISA基本原理和Digital PCR類似。為了檢測血液中的低豐度蛋白質，Simoa用特異性抗體修飾的微珠捕獲靶標生物標志物，在生物標志物濃度很少時，每個珠子能捕獲一個或零個靶蛋白質分子，通過免疫反應后形成免疫復合物，然后用能夠產生熒光產物的酶報告信號。通過把單個珠子限定在50 fL反應室中，使用熒光成像來檢測單個格子的熒光信號進行最后定量。這種單分子酶聯免疫吸附試驗（Digital ELISA）方法具有在100 μL樣品中檢測到少至約 10-20個酶標記的復合物。
Digital ELISA的檢測步驟
Simoa的檢測步驟可分為捕獲、封裝、成像三步（Loading, sealing, and imaging）。
磁微粒免疫捕獲
使用直徑為2.7微米的磁珠標記特異性抗體。通常而言，一個磁珠上有大約250000個識別位點，保證了識別的效率。將含有500000個標記磁珠加入到100微升樣本中，保證每個磁珠盡可能的只捕獲到一個生物標志物，并盡可能的把所有標志物都捕獲到。余下步驟和普通的磁微粒酶觸化學發(fā)光類似，經過清洗和偶聯酶聯抗體形成最后的磁微粒免疫復合物。
磁微粒的陣列封裝
Simoa使用蝶式芯片的方式將磁微粒進行分裝并利用超靈敏熒光探針對熒光信號進行檢測。這兩部分屬于Quanterix的核心技術。純化后的磁微粒免疫復合物被加入到芯片表面微孔反應室中，由于每個微孔的尺寸（4.25微米寬，3.25微米深）只能容下一個微球，并且被硅油封閉，使得可以使用直接計數或泊松分布公式得到生物標志物的含量。
Simoa的蝶式芯片具有24路檢測通道，每個通道都含有216000個微孔陣列。通常而言，微孔的數量越多，制造難度和成本也越大，這部分應該也屬于Quanterix的核心技術。
熒光成像和蛋白定量
圖像的獲取是通過CCD進行成像。通過軟件控制CCD進行長時間曝光獲得明場和熒光照片，從兩幅照片中獲得熒光點占總顆粒的百分比進而確定生物標志物濃度。對于更高濃度的生物標志物，還可以利用CCD采集模擬信號值進行檢測，這種方法大大擴大了其檢測動態(tài)范圍。
QUANTERIX簡介
2007年，Walt成立了Quanterix Corporation。公司總部位于美國馬薩諸塞州，規(guī)模很小，只有數十名員工。不過，Quanterix自主研發(fā)的單分子免疫陣列技術（SiMoA）是目前商業(yè)化產品中最靈敏的免疫分析方法，還已經具備多重檢測能力。
Quanterix公司一直致力于數字化的蛋白標志物研究，推動精準醫(yī)療發(fā)展。其核心技術是 simoa (single molecular array)，即單分子陣列技術，科學創(chuàng)始人之一是美國工程院和醫(yī)學院院士David R. Walt教授（illumina創(chuàng)始人之一）。2017年12月在美國納斯達克上市(nasdaq: qtrx)。
Quanterix推出的儀器都是基于simoa技術，simoa可實現單個分子檢測，靈敏度達到飛克級別（fg/ml），比傳統elisa方法靈敏度高出1000 倍。應用于腫瘤，神經、心血管、感染性疾病和免疫炎癥等領域蛋白標志物檢測，以及mirna檢測。
Walt博士不僅是Quanterix科學顧問委員會的科學創(chuàng)始人和主席，其也是基因測序龍頭企業(yè)Illumina的創(chuàng)始人兼董事。他是塔夫茨大學的羅賓遜化學教授和霍華德休斯醫(yī)學研究所的教授。Walt博士是美國國家工程院院士，美國科學促進會成員，美國醫(yī)學和生物工程研究所研究員。Walt博士是多個期刊的編輯顧問委員會成員，包括分析化學，分析和生物分析化學，傳感器快報和印度生物技術雜志。
產業(yè)化情況
目前Quanterix有多種通量的儀器以滿足不同的應用需求，其中最出名的是Simoa HD-1。具體檢測性能和儀器參數如下所示。
檢測性能
參數 | Simoa HD-1 |
靈敏度 | 比現有的常規(guī)免疫檢測平均高1000倍以上 |
動態(tài)范圍 | >4 logs |
精準度 | <10% CVs |
儀器參數
參數 | Simoa HD-1 |
通量 | 68個檢測／小時 >500個數據點／天 |
工作流程 | 批處理（96孔板或樣本管） |
總檢測時間 | <2.5小時／96孔板 |
手工操作時間 | 準備時間<20分鐘 |
自動化 | 全自動（從樣本進入到數據產出） |
上樣 | 96孔板或樣本管 |
上樣體積 | 1ml*-100ml |
儀器空間 | 135×60×160cm，落地式 |
多重分析能力 | 一個樣本10重檢測 |
目前Simoa的商品化試劑盒已經覆蓋腫瘤、神經、心血管、免疫等。通過Simoa可以直接對血清和血漿中蛋白、miRNA等標志物進行超高靈敏度檢測，極大的推動腫瘤、神經、感染性疾病和免疫炎癥，特別是癌癥的早期檢測，術后的檢測和精準用藥。國內杭州紐藍科技有限公司是Quanterix中國區(qū)總代理。2018年，佰美基因和Quanterix合作成立佰美-Quanterix中國合作研究中心。
具體的檢測項目如下所示
