長鏈非編碼RNA(long coding RNA，lncRNA)是一類轉錄本水平超過200nt、不編碼蛋白的RNA。LncRNA起初被認為是基因組轉錄的“噪音”，不具備生物學功能。然而，近幾年的研究表明lncRNA能在表觀遺傳、轉錄及轉錄后水平上調控基因表達、參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要調控過程，與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展和防治都有密切聯(lián)系。

● 技術重復性高：同一樣本重復建庫相關性Pearson值大于0.993
● 高特異性：使用特定方法降低樣本中rRNA的豐度
● 高準確度：構建鏈特異性轉錄組文庫，快速、高效、準確地獲取樣本中幾乎全部的lncRNA序列及其位置信息
● 分析嚴格：系統(tǒng)鑒定已知lncRNA，設置嚴格的篩選條件用于發(fā)現(xiàn)新的lncRNA
● lncRNA深入分析：lncRNA cis和trans調控機制以及ceRNA調控機制等
● 經驗豐富：已對多種動植物的lncRNA進行測序分析

● 測序平臺：Hiseq X 10/Nova seq
● 測序類型：PE150
● 測序數據量：10 G/樣本

1) 樣品純度：OD 260/280值應在1.9～2.2 之間。
2) 樣品濃度：最低濃度不低于100ng/ul。
3) 樣品總量：每個樣品總量不少于2μg。
4) 樣品溶劑：總RNA溶解于DEPC-水或者RNase-free的緩沖液中。
5) 樣品運輸： RNA用凍存管保存，并用干冰或液氮運輸。

一、標準分析：

1) 原始數據預處理：去除接頭污染、低質量序列得到clean data，去除核糖體RNA數據，數據產出統(tǒng)計及測序數據質量評估。
2) 序列拼接比對：比對分析、數據拼接為后續(xù)做準備；基因組mapping，轉錄本組裝。
3) lncRNA篩選及注釋：已知lncRNA（采用NONCODE、lncrnadb、Ensembl、NCBI、UCSC等多個lncRNA數據庫的集合或者自定義數據庫篩選并注釋已知lncRNA；）；多種算法（PhyloCSF預測算法與CPC預測算法）預測新的lncRNA。
4) lncRNA定量及差異分析：差異分析需2個或2個樣品以上。
5) 差異lncRNA靶基因預測：通過共表達或者位置關系分析lncRNA的靶基因。
6) 差異轉錄本分析：利用軟件比較各轉錄本在不同樣本間的差異表達，篩選差異轉錄本。
7) 結構分析：AS/SNP/InDdel分析，分析轉錄本結構變化。
8) 功能通路富集分析：差異lncRNA靶基因的GO analysis；差異lncRNA靶基因的pathway analysis。

二、高級數據分析

● Gene Expression Trend Analysis (時序分析)

   對于按照處理時間、濃度、疾病惡化程度順序設計的序列實驗，為了篩選出隨樣本順序變化影響最顯著、最主流的lncRNA群，需要對樣品的差異lncRNA進行表達趨勢分析。應用模糊聚類等機器學習方法，計算出隨著時間、濃度梯度或惡性程度等變化過程中l(wèi)ncRNA的表達趨勢，得到相應的主流表達趨勢，其所屬lncRNA的表達變化與時間、濃度、惡性程度具有顯著性聯(lián)系的lncRNA，主流表達趨勢所屬lncRNA將作為進一步研究的目標基因。

 ● Co expression Network(lncRNA-mRNA)

    Co expression Network是分析lncRNA與mRNA相互作用關系的創(chuàng)新工具。Coexpression Network根據lncRNA及mRNA的實測值，通過共表達計算方法構建網絡。通過lncRNA周邊與其共表達的mRNA來預測未知lncRNA的功能。Coexpression Network可以幫助發(fā)現(xiàn)lncRNA與mRNA之間可能存在的作用關系，能夠找到影響mRNA表達的lncRNA，從而發(fā)現(xiàn)網絡中起中心調控作用的lncRNA及發(fā)現(xiàn)lncRNA可能存在的新作用機制。由于共表達調控網絡是基于芯片的實測表達值運算的結果，故而突破了傳統(tǒng)分析中基因注釋不齊全的限制，大大增加了研究的創(chuàng)新性。結果樣式如下：

● lncRNA Target Pathway Network

       根據差異lncRNA和被調控靶基因的顯著性通路，利用lncRNA和靶基因通路的屬性，構建lncRNA Target Pathway Network。該網絡反映目標lncRNA對Pathway的作用關系。根據網絡中各lncRNA的位置函數計算出網絡特征值。特征值最高的lncRNA處于網絡的樞紐性地位，該lncRNA對多個Pathway和樣本狀態(tài)有重要的調控價值，同時，評價Pathway在網絡中的特征值，可以發(fā)現(xiàn)差異lncRNA所調控的核心通路。

● ceRNA Network

     分別對miRNA與mRNA、miRNA與lncRNA進行靶向預測，并根據表達趨勢取負相關。根據結果找出具有mRNA-miRNA-lncRNA關系的mRNA/lncRNA對。計算差異基因和差異lncRNA間的共表達關系，挑選出互為正相關的基因與lncRNA。根據上述分析結果，選出存在于mRNA-miRNA-lncRNA關系中，并互為正相關的mRNA/lncRNA對。這對mRNA/lncRNA即可能互為ceRNA，再通過MREs的數量和結合分值評估ceRNA的競爭能力。結果樣式如下：