在很多基礎(chǔ)研究的文獻(xiàn)中，我們會(huì)看到說(shuō)文章發(fā)現(xiàn)了某個(gè)蛋白和某個(gè)疾病有關(guān)。這就告訴我們一個(gè)線索，可能這個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)的基因可能和疾病也有關(guān)。

此時(shí)，我們可以有一個(gè)“欲擒故縱”的思路:就是先擴(kuò)大單個(gè)蛋白，單個(gè)基因到一個(gè)基因簇，再根據(jù)這一簇基因，去篩選可以預(yù)測(cè)預(yù)后的組合。比如今天我們分享的文獻(xiàn)。

近年來(lái)有關(guān)乳腺癌的研究越來(lái)越多，其中三陰性乳腺癌（TNBC）占乳腺癌的15％，但是目前組織臨床特征和預(yù)后基因表達(dá)特征（GES）未能識(shí)別預(yù)后良好和不良的患者。先前的研究表明酪氨酸激酶（TK）代表TNBC的潛在預(yù)后或治療靶標(biāo)。那么今天小編為大家?guī)?lái)的這篇文章中作者試圖在大量的TNBC中定義預(yù)后的TK GES，最后建立了一個(gè)預(yù)后分類器可以將TNBC分為不同的亞組。

材料和方法：

數(shù)據(jù)來(lái)源：

（1）腫瘤樣本和激酶基因

作者從16個(gè)數(shù)據(jù)集中得到6379名原發(fā)性乳腺癌患者的病理學(xué)以及mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。其中所有樣本均來(lái)自未經(jīng)預(yù)處理的患者的手術(shù)標(biāo)本，具有組織學(xué)證實(shí)的非轉(zhuǎn)移性侵襲性三陰性乳腺癌，并且具有可獲得的臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)，并且之前已經(jīng)使用DNA微陣列或RNA測(cè)序進(jìn)行了分析。

作者在771激酶以及激酶相互作用基因的列表中選擇了總共86個(gè)編碼酪氨酸激酶的基因。

（2）基因表達(dá)數(shù)據(jù)

這里作者對(duì)三陰性乳腺癌的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理。首先，作者分別對(duì)每個(gè)基于DNA微陣列的數(shù)據(jù)集進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)可用處理的Agilent數(shù)據(jù)進(jìn)行分位數(shù)歸一化，對(duì)原始Affymetrix數(shù)據(jù)使用非參數(shù)分位數(shù)算法進(jìn)行Robust Multichip Average（RMA）。使用Bioconductor和相關(guān)包在R中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。然后，作者在不同的技術(shù)平臺(tái)上繪制了探針，使用SOURCE和NCBI EntrezGene來(lái)檢索和更新Affymetrix注釋的Agilent Annotation和NetAffx Annotation文件，然后根據(jù)其Entrez Gene ID對(duì)探針進(jìn)行定位。當(dāng)多個(gè)探針表示相同的GeneID時(shí)，作者保留了特定數(shù)據(jù)集中方差最大的探針。對(duì)于TCGA數(shù)據(jù)，作者使用了記錄的標(biāo)準(zhǔn)化RNA-Seq數(shù)據(jù)，并使用z分?jǐn)?shù)歸一化校正批次效應(yīng)。

方法：

（1）基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析

（2）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果展示：

結(jié)果一：患者統(tǒng)計(jì)

作者收集了16個(gè)公共的全基因組mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)集，包括6379個(gè)原始BC樣本，并選擇了具有可用生存信息的1226個(gè)TNBC樣本進(jìn)行研究?；颊邩颖镜拿枋鋈绫?所示。

表1：三陰性乳腺癌樣本的描述

結(jié)果二：鑒定魯棒的預(yù)后酪氨酸激酶signature

在該部分作者在86個(gè)酪氨酸激酶基因列表中搜索了與無(wú)病生存（DFS）相關(guān)的基因表達(dá)特征。本工作的流程圖如圖1所示，在825個(gè)TNBC樣本的訓(xùn)練集中進(jìn)行的監(jiān)督分析鑒定了與DFS相關(guān)的25個(gè)基因，并且在Akaike信息標(biāo)準(zhǔn)（AIC）逐步回歸分析后保留了13個(gè)基因（圖2A），這13個(gè)基因包括在預(yù)后分類器中。

圖1：流程圖

正如預(yù)期的那樣，該13個(gè)基因的分類器在訓(xùn)練集中顯示出預(yù)后價(jià)值（圖2B）：5年DFS在“高風(fēng)險(xiǎn)”類中為52％， “低風(fēng)險(xiǎn)”類別中74％。接下來(lái)作者在驗(yàn)證集中對(duì)該分類器的預(yù)后效能進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明了該分類器的穩(wěn)健性（圖2C）。然后，作者通過(guò)重新采樣方案生成從86個(gè)TK基因列表中提取的100000個(gè)隨機(jī)的13基因特征，并在驗(yàn)證集中測(cè)試其預(yù)后值。該13基因特征作為隨機(jī)特征的可能性非常低。

圖2：

結(jié)果三：13基因分類器與臨床病理和分子特征的相關(guān)性

為了更好地表征該分類器，作者在整個(gè)數(shù)據(jù)集（N = 1226）中搜索了與腫瘤的臨床病理學(xué)和分子變量的相關(guān)性，其中612被分類為“高風(fēng)險(xiǎn)”而614被分類為“低風(fēng)險(xiǎn)”（表2）。與“高風(fēng)險(xiǎn)”類相比，“低風(fēng)險(xiǎn)”類在病理性3級(jí)腫瘤，淋巴結(jié)陽(yáng)性腫瘤， pT1腫瘤和免疫調(diào)節(jié)Lehmann亞型中富集。與其他臨床病理學(xué)變量（患者病例，病理類型）或三種主要預(yù)后GES無(wú)關(guān)。

表2：13基因分類器與臨床病理和分子特征的相關(guān)性

結(jié)果四：DFS的單變量和多變量預(yù)后分析

作者比較了該13個(gè)基因的分類器對(duì)DFS的預(yù)后價(jià)值與驗(yàn)證集中其他臨床病理學(xué)和分子變量的預(yù)后價(jià)值。在單變量分析中（表3），四個(gè)因素與DFS相關(guān)：Lehmann's亞型，LCK特征，Bindea CD8 T-細(xì)胞特征和13基因特征，風(fēng)險(xiǎn)比（HR）為1.72。

表3：驗(yàn)證集中DFS的單變量和多變量預(yù)后分析。

結(jié)果五：總體生存的單變量和多變量預(yù)后分析

在這一部分作者比較了該13個(gè)基因的分類器對(duì)整體存活（OS）的預(yù)后價(jià)值與整個(gè)人群中其他臨床病理學(xué)和分子變量的預(yù)后價(jià)值。在單變量分析中（表4），8個(gè)因素與OS相關(guān)：病理分級(jí)，淋巴結(jié)狀態(tài)，腫瘤大小，Lehmann's亞型，28基因免疫激酶特征，LCK特征，Bindea CD8 T細(xì)胞特征和13基因特征，死亡風(fēng)險(xiǎn)比（HR）為高風(fēng)險(xiǎn)患者是低風(fēng)險(xiǎn)患者的1.88倍。

表4：OS的單因素和多因素預(yù)后分析

對(duì)于“高風(fēng)險(xiǎn)”患者，5年OS為64％，而“低風(fēng)險(xiǎn)”患者為79％（圖3）。在多變量分析中，該13個(gè)基因的特征仍然顯著，表明了獨(dú)立的預(yù)后價(jià)值。

圖3：根據(jù)13基因分類器的Kaplan-Meier總生存（OS）曲線

結(jié)果6：與13基因分類器相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程

為了更好地探索由該13個(gè)基因的分類器定義的“低風(fēng)險(xiǎn)”和“高風(fēng)險(xiǎn)”TNBC樣本之間的分子差異，作者在全基因組數(shù)據(jù)中使用監(jiān)督分析搜索了最大樣本集中兩個(gè)類別之間差異表達(dá)的基因。使用嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，作者確定了480個(gè)差異基因，包括333個(gè)在“低風(fēng)險(xiǎn)”樣本中過(guò)表達(dá)，147個(gè)在“高風(fēng)險(xiǎn)”樣本中過(guò)表達(dá)（圖4A）。正

如作者預(yù)期的那樣，該基因列表準(zhǔn)確地將來(lái)自訓(xùn)練集的樣本分類，但更重要的是準(zhǔn)確地將來(lái)自獨(dú)立驗(yàn)證集的891個(gè)樣本分類（圖4B），表明其穩(wěn)健性。基因本體分析表明，在“低風(fēng)險(xiǎn)”樣本中過(guò)表達(dá)的基因特別參與免疫反應(yīng)，而在“高風(fēng)險(xiǎn)”樣本中過(guò)表達(dá)的基因參與mRNA翻譯成蛋白質(zhì)和細(xì)胞周期進(jìn)程的過(guò)程（圖4C）。

圖4：根據(jù)該13個(gè)基因的分類器監(jiān)測(cè)“高風(fēng)險(xiǎn)”和“低風(fēng)險(xiǎn)”TNBC之間表達(dá)譜的分析

結(jié)果七：該13個(gè)基因的分類器的預(yù)后或預(yù)測(cè)價(jià)值

為了確定該分類器與轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)或化療反應(yīng)的聯(lián)系，作者在1226例手術(shù)TNBC患者中分析了668例未接受任何輔助全身治療的患者。在這組患者中，“低風(fēng)險(xiǎn)”患者的DFS比“高風(fēng)險(xiǎn)”患者的長(zhǎng)，5年的DFS分別為79%和60%。然后，作者評(píng)估了該分類器預(yù)測(cè)基于蒽環(huán)類的新輔助化療的病理完全反應(yīng)（pCR）的能力。pCR定義為在化療后手術(shù)期間切除的乳腺和淋巴結(jié)中沒(méi)有侵襲性殘留癌。該研究的數(shù)據(jù)集中提供了257例TNBC患者的信息，包括78例pCR樣本和105例“低風(fēng)險(xiǎn)”和152例“高風(fēng)險(xiǎn)”?！暗惋L(fēng)險(xiǎn)”患者和“高風(fēng)險(xiǎn)”患者的pCR率相似。在這257名患者中，pCR率與其他免疫相關(guān)的特征之間不存在相關(guān)性。