單分子測(cè)序是一種重要測(cè)序技術(shù)思路。其特點(diǎn)是用于測(cè)序的DNA模板無(wú)需擴(kuò)增，測(cè)序儀直接對(duì)模板DNA進(jìn)行測(cè)序。其基本原理仍是Sanger法，一個(gè)循環(huán)中只加入一種可逆終止基團(tuán)，只有與該位核苷酸互補(bǔ)的模板才能參入單個(gè)熒光標(biāo)記的核苷酸。在反應(yīng)完畢、洗滌、單色成像確定方位和強(qiáng)度后，切除熒光標(biāo)記，再洗滌，進(jìn)行下一輪反應(yīng)。通過(guò)摻入、檢測(cè)和切除的反復(fù)循環(huán)，即可實(shí)時(shí)讀取序列。

單分子測(cè)序的創(chuàng)新在于采用了超敏感的熒光檢測(cè)裝置，不再依賴擴(kuò)增來(lái)增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，不存在擴(kuò)增誤差，避免了“不均一”問(wèn)題，可以直接分析堿基的化學(xué)修飾，因此在數(shù)字表達(dá)譜的研究方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。但其讀長(zhǎng)較短，僅在25nt~75nt之間，平均約35nt，每個(gè)循環(huán)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出量為21~28Gb。

納米孔測(cè)序（nanopore sequencing）最早由哈佛大學(xué)的DanielBranton、加州大學(xué)圣克魯斯分校的David Deamer、和牛津大學(xué)的Hagan Bayley于1995年提出。其主要特點(diǎn)是根據(jù)單鏈 DNA（SSDNA：singlestranded DNA)或RNA穿過(guò)納米孔而帶來(lái)的“信號(hào)”變化進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)序。在原理上與經(jīng)典的Sanger法有本質(zhì)不同，也具有高速度、高通量和低成本的優(yōu)勢(shì)。

納米孔測(cè)序的基本原理是當(dāng)納米孔灌滿導(dǎo)電液時(shí)，兩端加上一定的電壓，分子模板通過(guò)納米孔生成可以測(cè)量的電流。當(dāng)納米孔的直徑恰好只能容納一個(gè)核苷酸（1.5納米）時(shí)，長(zhǎng)達(dá)1000個(gè)堿基的單鏈DNA或RNA在電場(chǎng)作用下就會(huì)依次穿過(guò)這個(gè)納米孔，引起電流強(qiáng)度的改變，由于四種堿基空間構(gòu)象不同，引起納米孔電流改變的強(qiáng)度不同，四種堿基分別產(chǎn)生特定的電流峰值，以此即可判斷不同的堿基，實(shí)現(xiàn)高速實(shí)時(shí)測(cè)序。

目前用于DNA測(cè)序的納米孔基本分為生物納米孔和物理納米孔兩類。

生物納米孔（biology nanopore）類似于真核細(xì)胞核膜上的核孔，實(shí)質(zhì)上是遍布在納米芯片上的特異蛋白質(zhì)。生物納米孔多采用α溶血素（一般嵌入細(xì)胞雙層脂膜之中），其最窄出直徑約為1.5納米，恰好允許單鏈DNA或RNA通過(guò)，這些生物納米孔的大小嚴(yán)格一致，測(cè)量不同堿基通過(guò)納米孔時(shí)的電信號(hào)，即可獲得序列信息，不過(guò)目前生物納米孔在膜穩(wěn)定性和電流噪聲處理方面還存在一些問(wèn)題。

物理納米孔主要用硅或其他無(wú)機(jī)材料制造，一般使用離子束或電子束在硅或其他材料薄膜表面制造出納米尺度的小孔，再進(jìn)一步對(duì)小孔的性狀和大小進(jìn)行修飾而成。理想的納米孔厚度不能超過(guò)3納米，但目前工藝做到的厚度超過(guò)20納米，還需大幅提高加工工藝。相對(duì)生物納米孔，物理納米孔在提高穩(wěn)定性、降低電流噪聲、工藝集成方面有顯著優(yōu)勢(shì)，但固態(tài)納米孔制造工藝復(fù)雜、造價(jià)昂貴、成品率也較低。

雜交測(cè)序SBH（Sequencing By Hybridization）是測(cè)序技術(shù)的另一種重要思路，這一技術(shù)源于上世紀(jì)80年代蘇聯(lián)恩格爾哈特分子生物學(xué)研究所（EIMB）和美國(guó)阿貢國(guó)家實(shí)驗(yàn)室ANL的科研人員提出的點(diǎn)雜交技術(shù)（又稱點(diǎn)寡核苷酸雜交技術(shù)），其原理是精確控制雜交過(guò)程中的變性溫度，以是否能夠雜交來(lái)區(qū)別模板DNA與已知探針之間單個(gè)核苷酸的差異。其設(shè)想是將待測(cè)的模板分子作為雜交探針，與芯片上陣列的高密度寡核苷酸雜交，然后根據(jù)雜交信號(hào)來(lái)推導(dǎo)出模板的陣列。另外，熒光標(biāo)記和高密度芯片使雜交測(cè)序可以實(shí)現(xiàn)高精度和高通量。但由于芯片上高密度寡核苷酸陣列設(shè)計(jì)復(fù)雜、序列推導(dǎo)困難，這一技術(shù)至今仍沒(méi)有在基因組測(cè)序領(lǐng)域得到成功應(yīng)用。近年來(lái)雜交測(cè)序技術(shù)有一定的發(fā)展，出現(xiàn)了霰彈雜交測(cè)序法（Shotgun-SBH）、雜交輔助納米孔測(cè)序（Hybridization Assisted Nanopore Sequencing-HANS）和納米液滴測(cè)序技術(shù)。

顯微測(cè)序是用電子顯微鏡來(lái)直接觀察DNA堿基結(jié)構(gòu)的差異，從而讀取DNA序列的方法，是最直接的物理測(cè)序思路，目前發(fā)展仍停留在嘗試階段。顯微測(cè)序有多個(gè)技術(shù)發(fā)展方向，其中最有實(shí)現(xiàn)前景的是：?jiǎn)紊癫钚Ｕp光束低能量電子顯微鏡測(cè)序（Monochromatic Aberration-Corrected Dual-Beam Low Energy Electron Microscopy），可能因?yàn)槊Q實(shí)在太長(zhǎng)，因此該技術(shù)的發(fā)明者又重新起了一個(gè)更好記的名字：Elextron Optica。這項(xiàng)技術(shù)可以直接讀取堿基序列，無(wú)需標(biāo)記或任何修飾，也省去了樣本制備環(huán)節(jié)，而且較低的能量不會(huì)對(duì)核酸分子產(chǎn)生放射性損傷，錯(cuò)誤率也較低。