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通常全基因組甲基化分析作為一種高通量的篩選發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因的手段，常見的技術(shù)包括850K芯片，安捷倫捕獲測(cè)序，MeDIP-seq，RRBS，WGBS等。特異位點(diǎn)甲基化檢測(cè)一般在作為一種后期的技術(shù)驗(yàn)證手段，常見的技術(shù)包括：MSP、BSP、焦磷酸測(cè)序以及質(zhì)譜檢測(cè)。特異性位點(diǎn)的甲基化驗(yàn)證技術(shù)各有不同，我們又該如何選擇呢？今天小編將為大家介紹MSP、BSP、焦磷酸測(cè)序以及質(zhì)譜甲基化檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，以便于大家根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的驗(yàn)證技術(shù)。 Prosequencing(焦磷酸測(cè)序) 焦磷酸測(cè)序技術(shù)（Pyrosequencing）：是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。焦磷酸測(cè)序法適于對(duì)已知的短序列（<50bp）的測(cè)序分析，主要包括甲基化位點(diǎn)和單核苷酸多態(tài)性的定量檢測(cè)。隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，現(xiàn)在認(rèn)為焦磷酸測(cè)序技術(shù)（Pyrosequencing）是甲基化檢測(cè)新的金標(biāo)準(zhǔn)。序列延伸過程中，根據(jù)C和T的摻入量來定量確定單個(gè)位點(diǎn)的C-T 比例。因此，不同位點(diǎn)的甲基化變異就能被準(zhǔn)確檢測(cè)，并給出精確的甲基化程度的數(shù)據(jù)。QIAGEN公司在焦磷酸測(cè)序的應(yīng)用上具有明顯的優(yōu)勢(shì)，目前提供三種焦磷酸測(cè)序儀器，通量由低到高，適合不同的應(yīng)用。PyroMark Q24 的強(qiáng)項(xiàng)在于可對(duì)多達(dá)24個(gè)樣品進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。需要大樣品量的應(yīng)用更適合在PyroMark Q96 ID 上進(jìn)行。在考慮到處理成百上千個(gè)樣品所需的大量試劑時(shí)，運(yùn)行通量最大化可能會(huì)使實(shí)驗(yàn)成本變得很高。而PyroMark Q96 MD裝有一臺(tái)高度靈敏的光檢測(cè)攝像頭，可以在減少試劑量的情況下對(duì)少量的DNA模板進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)序。這些不同平臺(tái)的推出，對(duì)于我們實(shí)際研究提供了更有效的檢測(cè)手段。   雖然焦磷酸測(cè)序可以進(jìn)行單個(gè)位點(diǎn)甲基化程度的精確定量，但是目前來看，測(cè)序的片段長(zhǎng)度還比較短，有效長(zhǎng)度約為60bp。 橫坐標(biāo)：依次加入的dNTP； 縱坐標(biāo)：相對(duì)熒光強(qiáng)度； 百分比：目的位點(diǎn)的甲基化頻率； 每個(gè)峰的高度代表該種dNTP的摻入情況，峰高與摻入的核苷酸數(shù)量成正比； 黃色柱狀：判定亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化是否完全。  MSP Herman等1996年在使用重亞硫酸鹽處理的基礎(chǔ)上新建的一種方法。它將DNA先用重亞硫酸鹽處理，這樣未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的不變，隨后行引物特異性的PCR。MS-PCR中設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，并要求：1.引物末端均設(shè)計(jì)至檢測(cè)位點(diǎn)結(jié)束;2.兩對(duì)引物分別只能與重亞硫酸鹽處理后的序列互補(bǔ)配對(duì)，即一對(duì)結(jié)合處理后的甲基化DNA鏈，另一對(duì)結(jié)合處理后的非甲基化DNA鏈。檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后甲基化DNA鏈的引物能擴(kuò)增出片段，則說明該被檢測(cè)的位點(diǎn)存在甲基化;若用針對(duì)處理后的非甲基化DNA鏈的引物擴(kuò)增出片段，則說明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化 。DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理后，以處理后的產(chǎn)物作為模板，加入甲基化特異性的引物(primerⅠ)或非甲基化的引物(primerⅡ)，進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，只有結(jié)合完全的甲基化或非甲基化特異性引物的片段才能擴(kuò)增出產(chǎn)物。   BSP 直接測(cè)序是由Frommer等提出的研究DNA甲基化方法過程是：重亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴(kuò)增所需片段,則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，最后,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并且與未經(jīng)處理的序列比較,判斷是否CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化。 這種方法一度被認(rèn)為是DNA甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)。它的過程如下：經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，將序列與未經(jīng)處理的序列進(jìn)行比較，判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。   質(zhì)譜（MALDI-TOF MS技術(shù)） 堿基特異性酶切（MassCLEAVE）實(shí)驗(yàn)首先需用亞硫酸鹽處理 DNA，經(jīng)過處理后 DNA 中的未甲基化的胞嘧啶 (C) 轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║），而甲基化的胞嘧啶則保持不變。然后利用 5' 末端帶有 T7- 啟動(dòng)子的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) SAP( 蝦堿性磷酸酶 ) 處理后再進(jìn)行堿基特異性的酶切反應(yīng)。酶切后 基因組 DNA 片段的大小和分子量取決于亞硫酸鹽處理后的堿基變化，結(jié)果使含與不含 CpG 位點(diǎn)的片段的質(zhì)量相差 16Da，飛行質(zhì)譜儀器則能測(cè)出每個(gè)片段的分子量，EpiTYPER 則能自動(dòng)報(bào)每個(gè)相應(yīng)片段的具體甲基化數(shù)。   現(xiàn)在我們?cè)偻ㄟ^1張表來具體的認(rèn)識(shí)各技術(shù)之間的特點(diǎn)和優(yōu)劣勢(shì)。  綜上所述，不同的技術(shù)都有其各自的優(yōu)劣勢(shì)，應(yīng)結(jié)合自身需求選擇適合的檢測(cè)技術(shù)。 END |
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