Science類器官特刊（一）丨類器官新技術(shù)——類器官和器官芯片的完美結(jié)合；

2009年，來自荷蘭的Hans Clevers團(tuán)隊(duì)在體外三維（3D）器官培養(yǎng)領(lǐng)域取得重大突破，成功地在體外培養(yǎng)出有自我更新能力、保持腸道腺窩絨毛狀結(jié)構(gòu)的小鼠腸道類器官（gut organoids）【1】。自此，類器官技術(shù)（organoids technology）在人類科學(xué)研究發(fā)展史中拉開了帷幕。

類器官（organoids），顧名思義，類似器官的模型，是一類由干細(xì)胞，包括多能干細(xì)胞（pluipotent stem cell, PSC）和成體干細(xì)胞（adult stem cell, ASC），在體外培養(yǎng)時(shí)形成的能夠進(jìn)行自我組裝的微觀三維結(jié)構(gòu)。因其與對(duì)應(yīng)的器官擁有類似的空間組織、保持一些關(guān)鍵特性并能夠重現(xiàn)部分生理功能，而被認(rèn)為是檢測(cè)人類生物學(xué)和疾病方面的新模型。相較于細(xì)胞系（cell lines）、基因工程鼠（genetically engineered mouse models, GEMMs）和人源化異種移植鼠（patient-derived xenografts, PDX）這些傳統(tǒng)的研究模型，類器官模型（鼠源類器官mouse-derived organoids, MDO和人源類器官patient-derived organoids, PDO）不但能夠取自正常組織和組織癌變過程中各個(gè)階段的腫瘤組織，而且其培養(yǎng)體系簡(jiǎn)單易操作，時(shí)間和金錢成本較低，且具有較高效率，因而得到廣大研究人員的親賴，被Nature Methods評(píng)為2017年生命科學(xué)領(lǐng)域年度技術(shù)。

2019年6月7日，來自美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室的David Tuveson和荷蘭Hubrecht 研究所的Hans Clevers在Science共同撰文Cancer modeling meets human orgaonid technology，總結(jié)了如何將類器官技術(shù)應(yīng)用于癌癥領(lǐng)域的研究。

一、創(chuàng)建腫瘤類器官生物樣本庫(kù)（biobanks）

目前，癌癥聯(lián)盟組織如國(guó)際癌癥基因組聯(lián)盟（International Cancer Genome Consortium，ICGC）、癌癥基因組圖譜計(jì)劃（The Cancer Genome Atlas， TCGA）所使用的大部分樣本都取自于原發(fā)腫瘤（primary tumors）。相比之下，PDO可以取自腫瘤發(fā)展過程中的任何階段，而且只需要一小部分腫瘤組織即可在體外進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)增。研究人員已經(jīng)在肝癌【2】、胰腺癌 【3】 和結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移【4】組織中，通過穿刺獲得活檢，成功的在體外進(jìn)行類器官培養(yǎng)。Gao et al甚至能夠?qū)⑶傲邢侔┗颊叩难h(huán)腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)成類器官【5】。也有研究人員從尿路（urine）【6】和支氣管肺泡（bronchial lavage）【7】 的正常細(xì)胞中成功培養(yǎng)類器官，但是目前還不清楚這些培養(yǎng)方法能否適用于這些組織來源的腫瘤類器官培養(yǎng)。

體外培養(yǎng)的PDOs能夠很好的反應(yīng)大部分腫瘤組織（bulk tumor）所具有的特性【4】。舉例來說，從結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）組織和癌旁正常組織中提取并培養(yǎng)的PDOs，通過分子機(jī)制和功能學(xué)分析可以發(fā)現(xiàn)，相比于正常的細(xì)胞，CRCs細(xì)胞具有大量且多樣性的突變【8】。雖然，每個(gè)腫瘤內(nèi)DNA甲基化多樣性和轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)是穩(wěn)定的，但是，即使是在同一個(gè)腫瘤當(dāng)中，抗癌藥物反應(yīng)卻是有所不同的，這說明表觀遺傳改變（epigenetic changes）在很大程度上影響著細(xì)胞的基因表達(dá)，形成腫瘤異質(zhì)，呈現(xiàn)不同的藥物反應(yīng)。這也是目前類器官技術(shù)面臨的一大挑戰(zhàn)，即如何能夠更好的追蹤和分析瘤內(nèi)異質(zhì)性。除此之外，另一大挑戰(zhàn)是在長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中，如何保證類器官不發(fā)生克隆漂變（clonal drift），盡管有研究表示這個(gè)發(fā)生的幾率很小【9】。

因此，針對(duì)各種不同突變細(xì)胞（或譜系）和不同器官組織所衍生出的類器官，為了能夠優(yōu)化其長(zhǎng)期培養(yǎng)條件，同時(shí)更好通過類器官認(rèn)識(shí)和研究腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，建立類器官生物樣本庫(kù)是很有必要的。目前，荷蘭非盈利類器官技術(shù)組織HUB（www.hub4organoids.eu）已經(jīng)建立了類器官生物庫(kù)，與ATCC（American Type Culture Collection）類似，具有超過800種已知遺傳信息等特性的不同類器官，供科研院校和公司企業(yè)選擇使用。同時(shí)，人類癌癥模型倡議組織（The Human Cancer Models Initiative, HCMI）也在不斷建立不同的腫瘤培養(yǎng)模型，并將其發(fā)展成為共享資源。

類器官技術(shù)能夠體外模擬組織癌變過程

在研究組織癌變過程中，腫瘤類器官除了從處于不同發(fā)展階段的腫瘤組織中獲取，也可以通過對(duì)正常的類器官進(jìn)行基因編輯獲得，后者能夠單純地研究某個(gè)基因或某些基因組合的功能。

以CRC為例，根據(jù)腺瘤癌變次序論（adenoma-carcinoma sequence），CRC的發(fā)生發(fā)展過程是一系列基因按照特定順序接連發(fā)生突變的結(jié)果。J. Drost et al通過使用CRISPR/Cas9技術(shù)，依次在腸類器官內(nèi)突變APC, P53/TP53, KRAS 和 SMAD4后發(fā)現(xiàn)，突變后的腸類器官可以不依賴于任何外源細(xì)胞因子而進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖。當(dāng)把同時(shí)具有四種突變的類器官重新移植到小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，這些類器官誘導(dǎo)發(fā)生的CRC具有侵襲性（invasive CRC）【10】。A. Fumagalli et al 進(jìn)一步證實(shí)，有且只有四種突變同時(shí)發(fā)生時(shí)，腫瘤才能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移【11】。類似的，研究人員通過在正常巴雷特食管類器官突變APC使得細(xì)胞發(fā)生癌變 【12】；在正常大腸類器官內(nèi)同時(shí)突變Braf、Tgfbr2、Rnf43/Znrf3和P16/Ink4A而獲得具有鋸齒狀特性的腺癌 (serrated adenocarcinoma ) 【13】；在正常胰腺類器官內(nèi)依次突變KRAS, CDKN2A, TP53, and/or SMAD4而生成胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinomas）【14】。此外，編輯過的類器官也可以進(jìn)行亞克隆分選，進(jìn)而更好的研究基因功能。比如敲除關(guān)鍵的DNA修復(fù)基因并對(duì)突變的類器官進(jìn)行亞克隆后培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，有新的特定突變特征（mutational signature）的產(chǎn)生【15】。

得益于近年來干細(xì)胞基因敲入技術(shù)，類器官變得可視化。Sato T et al通過對(duì)干細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)GR5進(jìn)行譜系示蹤后發(fā)現(xiàn)，腫瘤發(fā)生過程中，LGR5 細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性，能夠進(jìn)行自我更新和分化能力 【16】。研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，將LGR5 腫瘤細(xì)胞敲除后，出現(xiàn)了短暫的腫瘤退化，之后，由KRT20標(biāo)記的分化腫瘤細(xì)胞能夠重新轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)GR5 自我更新的腫瘤干細(xì)胞，進(jìn)而繼續(xù)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，這表明了CRC的腫瘤生長(zhǎng)依賴于LGR5 的腫瘤干細(xì)胞，同時(shí)，已經(jīng)分化的腫瘤細(xì)胞也可以去分化成干細(xì)胞以補(bǔ)充腫瘤干細(xì)胞池內(nèi)的細(xì)胞缺失【16】。

目前，基于ASC的類器官技術(shù)無(wú)法進(jìn)行正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）組織進(jìn)行培養(yǎng)，但是，PSC衍生的類器官卻可以很好的模擬腦瘤的發(fā)生發(fā)展過程【17】。

二、類器官共培養(yǎng)技術(shù)助力表征腫瘤微環(huán)境和免疫治療

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME）是腫瘤細(xì)胞賴以生存的地方，無(wú)時(shí)無(wú)刻的影響著腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，然而，目前的研究技術(shù)手段還無(wú)法對(duì)微環(huán)境進(jìn)行表征。盡管腫瘤類器官培養(yǎng)體系并沒有包含完整的TME，然而，一些研究發(fā)現(xiàn)，將TME內(nèi)特定類型細(xì)胞與腫瘤類器官進(jìn)行共培養(yǎng)，可以在一些方面對(duì)TME進(jìn)行表征。將胰腺星型細(xì)胞與胰腺癌PDOs進(jìn)行共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，這些星型間質(zhì)細(xì)胞開始向胰腺腫瘤特有的纖維化特性間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，有一部分甚至已經(jīng)分化為腫瘤相關(guān)性成纖維細(xì)胞 (cancer-associated fibroblasts, CAF) ，他們通過分泌IL-6促進(jìn)類器官繁殖【18】。通過胰腺癌PDOs和CAF共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，腫瘤PDOs能夠誘導(dǎo)生成不同的CAF亞型，為腫瘤內(nèi)調(diào)控CAF組成提供依據(jù)【19】。

除了間質(zhì)細(xì)胞之外，微環(huán)境中另一種重要組成細(xì)胞是免疫細(xì)胞。目前與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)的探索還處于相對(duì)早期的階段。來自美國(guó)的Kuo團(tuán)隊(duì)從2009年就一直嘗試使用氣液交互（air-liquid interface，ALI）類器官培養(yǎng)技術(shù)還原原代腫瘤組織和微環(huán)境。2018年，他們通過使用該方法將PDOs和免疫細(xì)胞或成纖維細(xì)胞進(jìn)行一體化共培養(yǎng)，在長(zhǎng)達(dá)數(shù)周的時(shí)間里，病人T細(xì)胞克隆的多樣性仍然被很好的維持下來; 他們也順利地將這個(gè)技術(shù)應(yīng)用于評(píng)估免疫檢查點(diǎn)治療效果【21】。除此之外，將具有高突變負(fù)荷或煙草相關(guān)非小細(xì)胞肺癌的PDOs和對(duì)應(yīng)病人的外周血進(jìn)行共培養(yǎng)， 這些PDOs能夠很好地向T細(xì)胞呈遞抗原，從而使CD8 T細(xì)胞激活和增值【21】。原則上來講，這種方法可以在體外獲得大量效應(yīng)T細(xì)胞，然后對(duì)病人進(jìn)行過繼T細(xì)胞治療。

三、類器官技術(shù)正在成為個(gè)體化治療的工具

運(yùn)用類器官技術(shù)進(jìn)行個(gè)體化治療是指，通過體外對(duì)類器官進(jìn)行藥物篩選和基因型分析，制定適合這個(gè)個(gè)體的治療藥物和方法。截至到目前，不同腫瘤PDOs對(duì)傳統(tǒng)和正在研發(fā)的藥物所產(chǎn)生的反應(yīng)是各種各樣的。對(duì)目前有限的資源研究發(fā)現(xiàn)，大部分PDOs所展現(xiàn)的治療反應(yīng)和相對(duì)應(yīng)的病人剛開始對(duì)治療的反應(yīng)是一致的【22-26】。PDOs也可以用于針對(duì)被動(dòng)或獲得性耐受開發(fā)新的藥物【23】。更重要的是，PDOs對(duì)具有細(xì)胞毒性的藥物敏感性較強(qiáng)，因而可以更好的預(yù)測(cè)病人使用后的臨床反應(yīng)【24-26】。接下來，研究人員對(duì)大量個(gè)體PDOs的藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，找出共同特征，進(jìn)而對(duì)一類相似病人進(jìn)行生物標(biāo)記物開發(fā)研究【24】。

人們同時(shí)希望能夠?qū)㈩惼鞴偌夹g(shù)應(yīng)用成為類似“細(xì)菌檢測(cè)”一樣簡(jiǎn)單的“個(gè)體癌癥檢測(cè)”，美國(guó)Blue Ribbon Panel for the Cancer Moonshot也將這個(gè)想法提上了議程。目前的臨床實(shí)驗(yàn)研究可以將從有限個(gè)體中得出的結(jié)果（也即以經(jīng)驗(yàn)為依據(jù)的PDOs反應(yīng)）運(yùn)用于大量同類型的病人，同時(shí)，新開發(fā)的化療藥物也可以用同樣的方法來進(jìn)行檢測(cè)。如果在大量樣本中，PDOs的經(jīng)驗(yàn)檢測(cè)（empiric test）效果很好，那么，就可以擴(kuò)大設(shè)計(jì)合適的臨床實(shí)驗(yàn)（clinical trial）。

四、機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存

目前的類器官技術(shù)也面臨著大量挑戰(zhàn)，從類器官本身而言，不同器官腫瘤模型形態(tài)不易區(qū)分、不具有代表性；培養(yǎng)周期較長(zhǎng)；培養(yǎng)價(jià)格還不算親民；高通量藥物篩選和免疫治療篩選方法還不夠完善等等；從微環(huán)境而言，除了和免疫細(xì)胞或成纖維細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，如何能夠?qū)⒀芎蜕窠?jīng)細(xì)胞加入培養(yǎng)體系中進(jìn)行多維培養(yǎng)等等。然而，作者們始終相信，類器官技術(shù)會(huì)極大的促進(jìn)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域和臨床治療方面的研究，成為他們的好幫手。

原文鏈接：

https://science./content/364/6444/952

制版人：珂

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