瘤內(nèi)注射STING激動(dòng)劑能直接激活腫瘤浸潤(rùn)抗原遞呈細(xì)胞(APCs) ，可使治療后的淋巴瘤消退。由于STINGa激活在體外誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡，研究人員將STINGa（STING激動(dòng)劑）在體內(nèi)的直接治療和間接免疫治療特性進(jìn)行了區(qū)分。采用攜帶野生型或STING敲除腫瘤細(xì)胞的野生型或STING敲除宿主，團(tuán)隊(duì)證明局部腫瘤消退完全依賴于宿主的STING表達(dá)，由免疫介導(dǎo)。然而，在將STINGa注射到單個(gè)腫瘤部位后，遠(yuǎn)處未治療的腫瘤僅受到輕微影響。據(jù)此，利用目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的STINGa，我們篩選了能夠與STING通路協(xié)同作用的免疫調(diào)節(jié)劑，誘導(dǎo)全身抗腫瘤免疫反應(yīng)，使遠(yuǎn)處腫瘤消退。研究人員將STINGa與改善APC或T細(xì)胞功能的藥物聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)APCs和T細(xì)胞的調(diào)節(jié)都可以通過(guò)STINGa增強(qiáng)對(duì)遠(yuǎn)處淋巴瘤的控制，特別是，添加抗GITR抗體可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞在引流治療部位的淋巴結(jié)內(nèi)擴(kuò)張，然后在遠(yuǎn)處腫瘤中增加T細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，更多的CD8 T細(xì)胞在遠(yuǎn)處表達(dá)PD-1。因此，阻斷PD-1可進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤遠(yuǎn)端控制，使50%的小鼠治愈。這些臨床前數(shù)據(jù)為局部注射STINGa、隨后使用激動(dòng)劑抗GITR和抗PD-1抗體作為人類淋巴瘤的免疫治療提供了依據(jù)。

Figure 1. STING toxicity on lymphoma vs immunotherapeutic effect.

圖1 STING對(duì)淋巴瘤的毒性與免疫治療效果對(duì)比

圖1A：我們使用CRISPR Cas9敲除了BL3750 B細(xì)胞淋巴瘤系中的STING。

圖1B：正如所料，STING KO克隆在體外對(duì)STINGa(20 mg/mL)刺激具有抗性。

圖1C：為了評(píng)估STINGa作為原位疫苗的直接毒性作用，研究人員將WT或STING KO淋巴瘤細(xì)胞植入WT或STING KO小鼠中。每只小鼠植入兩個(gè)腫瘤，腹部每側(cè)1個(gè)。在腫瘤植入后第6,8和10天，將20mg STINGa或NS注入1個(gè)腫瘤并監(jiān)測(cè)兩個(gè)部位以評(píng)估局部和遠(yuǎn)處的影響（每組5-10只小鼠） 。

 1、STINGa治療對(duì)攜帶STING KO腫瘤的STING KO小鼠沒(méi)有影響。

2、在攜帶WT腫瘤的STING KO小鼠中，我們觀察到與載體處理的小鼠相比，注射的腫瘤的生長(zhǎng)暫時(shí)受損并且在遠(yuǎn)處位點(diǎn)延遲腫瘤生長(zhǎng)。

3、在攜帶STING KO腫瘤的WT小鼠中，治療側(cè)腫瘤消失，引起壞死的黑色瘢痕。此外，該療法延緩了遠(yuǎn)處腫瘤的生長(zhǎng)。

總結(jié)：這些數(shù)據(jù)顯示注射的腫瘤的清除和WT小鼠中的全身抗腫瘤作用獨(dú)立于腫瘤上的STING表達(dá)，但需要宿主中的STING表達(dá)。

Figure 2. STING in situ vaccination is improved when combined with CpG, anti-OX40, or anti-GITR.

圖2當(dāng)與CpG，抗OX40或抗GITR組合時(shí)，STING原位疫苗接種得到改善。

圖2A：每只小鼠植入兩個(gè)腫瘤（5*106），腹部每側(cè)1個(gè)。在腫瘤植入后第6,8和10天，將5mg STINGa瘤內(nèi)注射（IT）和其他聯(lián)合藥物注入1個(gè)腫瘤并監(jiān)測(cè)兩個(gè)部位以評(píng)估局部和遠(yuǎn)處的影響。

圖2B: 5 mg STINGa、5 mg CpG 瘤內(nèi)組合干預(yù)，能引起遠(yuǎn)隔效應(yīng)，增強(qiáng)STING原位疫苗接種。

圖2C: 5 mg STINGa瘤內(nèi)注射、 8 mg anti-OX40抗體遠(yuǎn)處皮下注射，能引起遠(yuǎn)隔效應(yīng)，增強(qiáng)STING原位疫苗接種。

圖2D: 5 mg STINGa瘤內(nèi)注射、50 mg anti-GITR抗體遠(yuǎn)處皮下注射，能引起遠(yuǎn)隔效應(yīng)，增強(qiáng)STING原位疫苗接種。

圖2E: 5 mg STINGa、5 mg Resiquimod 瘤內(nèi)組合干預(yù)，能引起遠(yuǎn)隔效應(yīng)，增強(qiáng)STING原位疫苗接種。

總結(jié): anti-OX40, anti-GITR, CpG, and Resiquimod：協(xié)同

         anti-CD47, anti-TIGIT, IDO inhibitors：無(wú)或者抑制

      因?yàn)镾TINGa和anti-GITR都是在臨床試驗(yàn)中單獨(dú)測(cè)試的，研究人員認(rèn)為這兩種藥物的組合最終在臨床測(cè)試中是合乎邏輯的。因此，決定進(jìn)一步研究這種特殊的組合。

         為了優(yōu)化治療，研究人員測(cè)試了不同的注射途徑《IT、腫瘤周圍（PT）、遠(yuǎn)處部位皮下注射（SC）》，也評(píng)估了其他腫瘤模型的治療。（圖3）

附圖3：治療的局部或全身遞送以及治療在其他腫瘤模型中的效果。

如圖所示：STINGa必須局部注射，但不一定注入腫瘤以誘導(dǎo)全身效應(yīng)。

1、 IT和PT注射STINGa引起的全身效應(yīng)相似，而當(dāng)在遠(yuǎn)處皮下施用STINGa時(shí)，主要效果喪失。然而，IT和PT注射的局部效應(yīng)是不同的; PT注射顯著減少了局部腫瘤的生長(zhǎng)，但沒(méi)有清除它，而IT注射使腫瘤變成瘢痕并清除它。

2、當(dāng)STINGa PT或遠(yuǎn)處部位SC時(shí)未觀察到瘢痕。

3、PT注射也起作用的事實(shí)表明STINGa靶向局部引流淋巴結(jié)中的APC以誘導(dǎo)全身性抗腫瘤作用。

圖3.全身性抗腫瘤反應(yīng)是T細(xì)胞介導(dǎo)的。

圖3A: 為了評(píng)估T細(xì)胞及其亞組在組合中的作用，研究人員使用合適的單克隆抗體從宿主中去除CD4 +，CD8 +或兩個(gè)亞組。在不同組中比較注射部位和遠(yuǎn)處部位的腫瘤生長(zhǎng)。消除CD8+T細(xì)胞的消耗損害了組合在治療和遠(yuǎn)處部位的治療效果。然而，CD4  +細(xì)胞的消耗不影響局部和全身抗腫瘤作用。

圖3B-3D: 在第6天，第8天和第10天，用瘤內(nèi)注射STINGa和/或皮下注射抗GITR處理小鼠。在第17天，收獲脾臟。在用腫瘤細(xì)胞（A20）或不相關(guān)的腫瘤細(xì)胞（4T1）再刺激后監(jiān)測(cè)產(chǎn)生INF-g的細(xì)胞。用A20細(xì)胞再次刺激仍可誘導(dǎo)CD4 +，CD8+ T細(xì)胞擴(kuò)增，而4T1則無(wú)反應(yīng)。

圖3E：在瘤內(nèi)注射STINGa或NS后2和4小時(shí)收獲經(jīng)處理的腫瘤。發(fā)現(xiàn)與NS治療的腫瘤相比，CD8+和CD4 +T細(xì)胞的總百分比沒(méi)有變化。然而，注意到STINGa處理的腫瘤中CD4+FoxP3+Tregs細(xì)胞的百分比較低。

小結(jié)：局部和全身抗腫瘤反應(yīng)需要CD8+T細(xì)胞，且 T細(xì)胞應(yīng)答具有特異性，另外，腫瘤浸潤(rùn)性Treg可能在STINGa處理后失去FoxP3表達(dá)。

為了了解STINGa和抗GITR之間治療協(xié)同作用的免疫機(jī)制，研究人員通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了治療腫瘤的引流淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞。如圖4A所示，我們將分析重點(diǎn)放在2點(diǎn)上： 在最后一次注射后1天，就在遠(yuǎn)處腫瘤開始響應(yīng)之前，并且在最后一次注射后1周，當(dāng)遠(yuǎn)處腫瘤已經(jīng)退化時(shí)。

Figure 4. Dissection of the immune response in the nontreated tumor.

圖4.未治療腫瘤中免疫應(yīng)答的剖析。

圖4B: 在遠(yuǎn)處腫瘤中，T細(xì)胞浸潤(rùn)在治療后1周增加。

圖4E-I:在遠(yuǎn)處腫瘤中，組合治療早在治療后1天就增加CD8 T細(xì)胞活化，如CD8 T細(xì)胞中ICOS 1，Ki67 1和CD69 1細(xì)胞的百分比更高所示。此外，表達(dá)低水平PD-1的細(xì)胞百分比在處理后1周更高。

Figure 5. Dissection of the immune response in the draining lymph node of the treated tumor.

圖5.處理的腫瘤的引流淋巴結(jié)中的免疫應(yīng)答的解剖。

圖5A-5B:在治療后一天，治療組中的引流淋巴結(jié)的大小更加突出，并且含有比對(duì)照組多3至5倍的細(xì)胞?？笹ITR治療誘導(dǎo)更大百分比的APC（CD11b），而STINGa增加活化的APC的比例（CD86）。聯(lián)合治療增加T細(xì)胞活化和增殖。

圖5C-5E:治療組：聯(lián)合治療增加T細(xì)胞活化和增殖。治療后一天組合治療的淋巴結(jié)在CD3 細(xì)胞中具有增加的CD8 T細(xì)胞比例，這導(dǎo)致CD8 / Treg比率增加。

圖5F-I:，聯(lián)合治療與CD8 T細(xì)胞活化增加相關(guān)，如表達(dá)CD69，Ki67和ICOS的細(xì)胞百分比較高，PD-1表達(dá)上調(diào)。

總結(jié)圖4圖5：根據(jù)結(jié)果所示，似乎在治療的腫瘤的引流淋巴結(jié)中開始免疫應(yīng)答。然后，它擴(kuò)散到遠(yuǎn)處的腫瘤。在淋巴結(jié)中，治療后1天比治療后1周有更多活化細(xì)胞，而遠(yuǎn)端腫瘤則觀察到相反的情況，并且遠(yuǎn)處免疫細(xì)胞PD-1表達(dá)的增加也為了免疫治療造勢(shì)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，聯(lián)合治療可誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和擴(kuò)張，這是由治療腫瘤引流淋巴結(jié)中活化的APCs數(shù)量較多引起的。

腫瘤引流淋巴結(jié)流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，治療后1周免疫反應(yīng)減弱。因此，團(tuán)隊(duì)研究延長(zhǎng)治療時(shí)間是否能延長(zhǎng)抗腫瘤反應(yīng)，從而增強(qiáng)全身效果。

Figure 6. Expending in situ vaccination in a second treated site improve the treatment.

圖6.在第二個(gè)處理部位進(jìn)行延長(zhǎng)原位接種疫苗療程可改善治療效果。

圖6A-6B：雙瘤建模同fig 1C。分為兩組，一組為一輪療程組（3針），另一組為三輪療程組（9針）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)將治療延長(zhǎng)到3個(gè)周期并沒(méi)有改善遠(yuǎn)處的結(jié)果。

針對(duì)此結(jié)果，研究人員分析：在第一輪治療后，注射的腫瘤消失并變成瘢痕。因此，對(duì)于第二輪STING疫苗接種，在治療部位沒(méi)有更多的腫瘤抗原可用。據(jù)此研究人員假設(shè)在第二周期期間具有用于注射STINGa的額外腫瘤部位將改善結(jié)果。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我研究人員在小鼠腹部植入了3個(gè)A20腫瘤（具體方法同前）。分為兩組，一組為一個(gè)腫瘤干預(yù)組，另一組為兩個(gè)腫瘤干預(yù)組。

圖6C-6D：在該方案中，與僅接受1個(gè)治療周期的小鼠相比，第三個(gè)位點(diǎn)的腫瘤生長(zhǎng)在接受2個(gè)連續(xù)治療周期的小鼠中顯示出更高的生長(zhǎng)延遲。此外，處理2個(gè)周期的小鼠比僅處理1個(gè)周期的小鼠存活顯著更長(zhǎng)。

結(jié)論：從這些數(shù)據(jù)中，我們可以得出結(jié)論，STINGa的抗腫瘤作用可以通過(guò)重復(fù)循環(huán)（即IT注射不同部位）來(lái)延長(zhǎng)。

在STINGa和抗GITR治療后，可以觀察到局部淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處腫瘤中PD-1表達(dá)細(xì)胞的增加。因此，研究人員繼續(xù)評(píng)估了PD-1阻斷的加入是否可以增強(qiáng)我們的治療效果。

Figure 7. PD-1 blockade improve STING 1 anti-GITR therapy.

圖7. PD-1阻斷改善了STINGa聯(lián)合抗GITR的治療效果。

結(jié)論：如圖所示，與任何雙重組合相比，三聯(lián)組合顯示遠(yuǎn)處位點(diǎn)的腫瘤控制得到改善，三療法的存活率也有所改善。

討論：該研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)證明注射腫瘤的清除完全取決于宿主細(xì)胞中的STING活化，并且STINGa對(duì)淋巴瘤細(xì)胞的直接毒性僅具有較小的影響，而且治療部位的腫瘤消退是T細(xì)胞介導(dǎo)的，其與治療腫瘤中CD4 +  FoxP3 + T細(xì)胞的早期減少有關(guān)。

  在篩選可以增強(qiáng)STING原位疫苗接種的化合物時(shí)，團(tuán)隊(duì)測(cè)試了APC刺激劑(抗CD47，CpG和Resiquimod)和T細(xì)胞調(diào)節(jié)劑(anti-OX40，抗GITR，抗TIGIT和IDO抑制劑)。其中，CpG，Resiquimod，抗OX40和抗GITR顯示出功效，表明調(diào)節(jié)APC或T細(xì)胞可以增強(qiáng)STING原位疫苗接種(治療過(guò)的和遠(yuǎn)處的腫瘤以及引流淋巴結(jié)。

  STINGa和GITR調(diào)節(jié)的組合刺激了局部和全身T細(xì)胞反應(yīng)。文章數(shù)據(jù)表明，STINGa在治療部位的引流淋巴結(jié)中激活了APC，與GITR共刺激一起誘導(dǎo)了該淋巴結(jié)中T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化和增殖。然后，活化的T細(xì)胞從該淋巴結(jié)遷移到遠(yuǎn)處的腫瘤并攻擊腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤消退。然而，在遠(yuǎn)處腫瘤部位，這些活化的T細(xì)胞很快被T細(xì)胞上表達(dá)的PD-1和腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的PD-L1之間的相互作用所抑制。用STINGa和抗GITR的組合治療的小鼠具有較高比例的PD-1low CD8  T細(xì)胞。該細(xì)胞亞群顯示為對(duì)PD-1阻斷有反應(yīng)的。使用抗PD-1抗體阻斷PD-1 / PD-L1相互作用能夠增強(qiáng)STINGa和抗GITR組合的治療效果，并治愈一半的老鼠。

  因此， STING原位疫苗聯(lián)合GITR和PD-1調(diào)節(jié)是一種很有前景的淋巴瘤治療方法。腫瘤內(nèi)注射STINGa會(huì)引起局部毒性，但這可以通過(guò)腫瘤周圍注射來(lái)避免。

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