目前，10x Genomics單細(xì)胞平臺(tái)憑借自身技術(shù)優(yōu)勢(shì)和成熟商業(yè)化逐步受到廣大科研人員的青睞，利用10x Genomics平臺(tái)發(fā)表的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文章已超過(guò)300篇，其中2019年至今已發(fā)表近百篇。10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序策略大大提高了通量，降低了成本，但由于整套體系基于無(wú)差別微流控分選，細(xì)胞懸浮液的質(zhì)量從很大程度上決定了實(shí)驗(yàn)的成敗。今天天津生物芯片就為大家總結(jié)幾條上機(jī)樣本預(yù)處理Tips，從源頭上幫助大家提高成功率

1，樣本制備

盡快解離獲得的新鮮組織樣本，制備成細(xì)胞單分散懸浮液，若時(shí)間不允許，可使用組織保存液對(duì)其進(jìn)行低溫運(yùn)輸或保存，保存條件為4 ℃冷藏但不可凍結(jié)，保存時(shí)間最多48 h；

建議通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化不同類型組織酶解的最佳條件，以提高組織解離獲得的細(xì)胞總數(shù)量；

細(xì)胞團(tuán)、組織碎片或細(xì)胞碎片會(huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確，雜質(zhì)顆?？赡軙?huì)造成芯片上的微流通道被堵塞，致使GEM制備失敗，應(yīng)使用細(xì)胞濾篩、死細(xì)胞去除（磁珠）試劑盒、碎片去除試劑盒等提高樣本純度和活性；

若樣本含有大量的紅細(xì)胞，應(yīng)使用紅細(xì)胞裂解試劑進(jìn)行紅細(xì)胞去除；

儀器捕獲率為65%，上機(jī)分選樣本需要根據(jù)細(xì)胞濃度和目標(biāo)捕獲數(shù)計(jì)算，并將樣本濃度盡量調(diào)至官方推薦最佳上樣濃度范圍（700-1200 個(gè)/uL）。

2，樣本保存

制備好的樣本應(yīng)時(shí)刻置于碎冰上保持活性等質(zhì)量，細(xì)胞懸浮液確定達(dá)標(biāo)后應(yīng)盡快上機(jī)（<30 mins），敏感脆弱細(xì)胞類型尤其需要注意實(shí)驗(yàn)時(shí)間；

推薦將樣本重懸于1x PBS（無(wú)鈣鎂）+0.04% BSA環(huán)境中（清洗也使用此體系），經(jīng)官方驗(yàn)證可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸的替換Buffer或培養(yǎng)基如下所示：

幾乎無(wú)影響：DPBS、HBSS；

影響較小：EMEM+10% FBS、DMEM+10% FBS、IMEM+10% FBS、RPMI+10% FBS、Ham's F12+10% FBS、1:1 DMEM/F12+10% FBS。

3，實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)

上機(jī)前應(yīng)進(jìn)行樣本清洗，細(xì)胞數(shù)目特別少時(shí)，可僅離心清洗一次，但必須保證去除鈣鎂離子和EDTA，建議使用寬口槍頭吹打細(xì)胞以保證活性，可向PBS中添加0.04% BSA減低細(xì)胞結(jié)團(tuán)率；

離心回收細(xì)胞時(shí)，一定要使用可控溫平轉(zhuǎn)子離心機(jī)，并調(diào)低離心機(jī)減速時(shí)的加速度（4-5），根據(jù)細(xì)胞尺寸大小等特征調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和時(shí)間（一般不超過(guò)400 Xg，5 mins）。

4，生信分析流程

測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)（比對(duì)基因組、基因表達(dá)定量）→ 細(xì)胞過(guò)濾與標(biāo)準(zhǔn)化→ 細(xì)胞亞群分類 → 差異基因篩選 → 差異基因功能分析（GO、KEGG）→ 標(biāo)記基因篩選

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