胃癌是最為常見的消化道惡性腫瘤之一，也是發(fā)病率和死亡率增長速度最快的惡性腫瘤之一^[1]。全世界每年新發(fā)病例有70%在發(fā)展中國家，其中我國每年新增病例大約占全球的40%^[2]，且患者趨于年輕化。盡管近年來對于胃癌早期的診療技術(shù)、外科切除技術(shù)以及放化療和免疫治療等多種綜合治療技術(shù)有所提高，但是患者5年生存率僅為25%～30%^[3-4]，術(shù)后胃癌細胞的轉(zhuǎn)移仍然是影響預后和5年生存率的主要因素。如何有效地改善進展期胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移仍然是臨床上面臨的一大難題。目前，眾多研究證明中藥在抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移等方面展現(xiàn)出較高的研究價值。

重樓Rhizoma Paridis以蚤休之名首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。其具有清熱解毒、消腫止痛的功效?，F(xiàn)代植物化學和藥理學研究證實從重樓中以醇提方式提取出來的化合物是天然的皂苷類成分，即重樓皂苷（Rhizoma Paridis total saponin，RPTS），也是抗腫瘤的主要活性成分^[5-7]。近年來大量研究展示了RPTS在抑制腫瘤細胞增殖、阻滯癌細胞周期、誘導癌細胞凋亡等方面具有顯著的作用^[8-11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)RPTS具有明顯的抑制胃癌細胞增殖的活性^[12-13]。研究表明氯化鋰（LiCl）能夠抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的表（MMP-9）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、環(huán)加氧酶-2（COX-2）等腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄和表達^[14-15]，參與了腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，血管生成以及遠端轉(zhuǎn)移^[16]?；谝陨涎芯勘尘?，本實驗研究RPTS對LiCl誘導的人胃癌MKN-45細胞遷移和侵襲能力的影響，并探討可能的作用機制。

1  材料

1.1  細胞

MKN-45細胞購自中國科學院上海細胞研究所細胞庫。

1.2  藥物與試劑

重樓飲片購自安徽濟仁藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地為云南，批號111012，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學中藥與資源教研室俞年軍教授鑒定，確認為云南重樓Paris polyphylla Smith var. yannanensis (Franch) Hand. -Mazz。DMEM高糖細胞培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國HyClone公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、LiCl（質(zhì)量分數(shù)＞99%）購自美國Sigma公司；Transwell小室（直徑8 μm）購自Millipore公司；MMP-9 ELISA試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；兔抗人VEGF多克隆抗體、COX-2抗體、GSK-3β抗體購自美國Cell Signaling公司；TRIzol RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、TRIzol RNA提取試劑、QuantiFast SYBR Green PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.3  儀器

Forma 370細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；純水-超純水凈化器（美國Millipore公司）；7500 Real-Time PCR儀（美國ABI公司）；SPEC-TRAMax M2e酶標儀（美國Molecular Devices公司）；FCM凝膠成像儀（美國Protein Simple公司）；PowerPac系列電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

2  方法

2.1  PRTS的制備

2.2  細胞培養(yǎng)

MKN-45細胞采用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO₂及飽和濕度條件下進行培養(yǎng)，待細胞長滿至瓶壁85%左右后按照1∶5進行傳代，取對數(shù)生長期細胞進行各項實驗。

2.3  MTT法檢測細胞增殖

將處于對數(shù)生長期的MKN-45細胞用胰酶常規(guī)密度10⁴個/mL，將細胞懸液以200 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，在37 ℃、5% CO₂的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，分別向各孔中加入終質(zhì)量濃度分別為0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL RPTS，每組6個復孔，另設空白組，繼續(xù)培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入5 mg/mLMTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，吸出上清后加入150 μLDMSO，搖床避光震搖15 min，用酶標儀測量各孔在490 nm處的吸光度（A）值，計算細胞活力。

細胞活力＝(A_實驗―A_空白)/(A_對照―A_空白)

2.4  細胞劃痕實驗檢測細胞遷移率

取對數(shù)生長期的MKN-45細胞，制成單細胞懸液并計數(shù)，調(diào)整細胞密度至7×10⁵個/mL，接種于6孔板中。置于37 ℃、5% CO₂的飽和濕度培養(yǎng)箱中，待細胞貼壁，用10 μL槍頭在孔板底部中央均勻劃出一條橫線，PBS清洗后，換無血清高糖DMEM培養(yǎng)，并在光學顯微鏡下觀察0 h細胞劃痕狀態(tài)，拍照。之后向各孔中分別加入終質(zhì)量濃度為0、2.5、5.0、10.0 μg/mL的RPTS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后在光學顯微鏡下拍照，觀察細胞遷移情況，并計算細胞24 h遷移率。

遷移率＝(劃痕寬度_{0 h}－劃痕寬度_24h)/劃痕寬度_{0 h}

2.5  Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力

將Matrigel基質(zhì)膠置于4 ℃冰箱中隔夜解凍，次日Matrigel基質(zhì)膠和預冷的無血清DMEM培養(yǎng)液按1∶3稀釋混合均勻，在Transwell小室內(nèi)加入100 μL混合液并均勻鋪展，放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置2 h，使基質(zhì)膠凝固。將Transwell小室置

2.6  ELISA法檢測細胞上清中MMP-9的表達

取對數(shù)生長期的MKN-45細胞，制成單細胞懸液并計數(shù)，調(diào)整細胞密度至7×10⁵個/mL，接種至6孔板中。待細胞貼壁后，除對照組外，其余各組細胞加LiCl（5 mmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后換液，加入不同質(zhì)量濃度RPTS（10、20、40 μg/mL），各組設置3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸出細胞上清液至1.5 mL EP管中，各組樣品和緩沖液按1∶5稀釋依次加入MMP-9 Elisa試劑盒當中，每孔50 μL，同時設置標準品組，置于37℃恒溫條件下孵育30 min，按說明書操作，酶標儀讀取480 nm處A值，記錄結(jié)果。

2.7  Western blotting法檢測細胞中VEGF、COX-2、GSK-3β蛋白表達

將處于對數(shù)生長期的MKN-45細胞，制成單細胞懸液并計數(shù)，調(diào)整細胞密度至7×10⁵個/mL，接種至6孔板中。待細胞貼壁后，除對照組外，其余各組細胞加LiCl（5 mmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，換液，并加入不同質(zhì)量濃度RPTS（10、20、40 μg/mL）放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束，棄去上清培，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育2 h。避光配制ECL發(fā)光試劑，并均勻涂抹在PVDF膜上蛋白條帶對應位置，于FCM凝膠成像儀中自動曝光。所得實驗蛋白條帶圖像經(jīng)凝膠圖像處理系統(tǒng)加以分析。

2.8  qRT-PCR法檢測細胞中VEGF、COX-2、GSK-3β mRNA表達

將已接種于6孔板中的MKN-45細胞經(jīng)過LiCl（5 mmol/L）處理24 h后，加入RPTS（10、20、40 μg/mL）繼續(xù)處理24 h，收集細胞，TRIzol法提取細胞總RNA，取少量RNA進行定量，之后取總RNA 1 μg/μL，用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，生成cDNA。再根據(jù)QuantiFast SYBR Green PCR試劑盒說明書進行qRT-PCR反應。引物序列為β-actin：上游5’-GAGAAAATCTG- GCACGSK-3β：上游5’-GAACTGTCAAG- TAATCCACCTCT-3’，下游5’-CCACGGTCTCCAG- TATTAGCATC-3’；VEGF：上游5’-TCACCAAGGC-

2.9  統(tǒng)計學分析

應用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。實驗數(shù)據(jù)以表示，各組指標采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較采用t檢驗。

3  結(jié)果

3.1  RPTS對MKN-45細胞增殖的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，RPTS 2.5 μg/mL組細胞活力受到影響較小。當RPTS質(zhì)量濃度增加到5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL時，細胞增殖受到明顯的抑制（P＜0.05、0.001），并且隨著質(zhì)量濃度的升高，細胞活力降低。結(jié)果見圖1。

3.2  RPTS對MKN-45細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，RPTS 2.5、5.0、10.0 μg/mL組細胞的劃痕距離顯著增加（P＜0.01、0.001），結(jié)果提示RPTS可顯著抑制MNK-45細胞的遷移，而且遷移抑制作用呈質(zhì)量濃度依賴關(guān)系，結(jié)果見圖2。

3.3  RPTS對MKN-45細胞侵襲能力的影響

Transwell小室下室細胞經(jīng)結(jié)晶紫染色，通過對下室細胞數(shù)量的觀察，可以看出與對照組比較，RPTS 2.5、5.0、10.0 μg/mL組下室侵襲細胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05、0.001），且表現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性，結(jié)果提示RPTS能抑制MKN-45細胞的侵襲，結(jié)果見圖3。

3.4  RPTS對LiCl誘導的MKN-45細胞MMP-9蛋白表達的影響

結(jié)果顯示（表1），與對照組比較，LiCl可顯著提高MKN-45細胞中MMP-9蛋白表達水平（P＜0.05），提示LiCl造模成功。與模型組比較，RPTS 10、20、40 μg/mL可顯著抑制MMP-9蛋白的表達，且呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。

3.5  RPTS對LiCl誘導的MKN-45細胞VEGF、COX-2、GSK-3β蛋白表達的影響

細胞VEGF、COX-2蛋白表達產(chǎn)生了顯著的抑制作用（P＜0.01）。RPTS可上調(diào)LiCl抑制的GSK-3β蛋白表達水平（P＜0.05、0.01），提示RPTS。

3.6  RPTS對LiCl誘導的MKN-45細胞VEGF、COX-2、GSK-3β mRNA表達的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，與模型組比較，RPTS 10、20、40 μg/mL對LiCl誘導的MKN-45細胞VEGF、COX-2 mRNA表達產(chǎn)生了顯著的抑制作用，與Western blotting結(jié)果一致。與對照組比較，模型組細胞GSK-3β表達無明顯差異，提示LiCl可能僅在蛋白水平調(diào)控GSK-3β的表達。與模型組比較，RPTS 20、40 μg/mL組細胞GSK-3β mRNA表達水平明顯上調(diào)（P＜0.01），結(jié)果見圖5。

4  討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在我國各種惡性腫瘤中發(fā)病率居首位。胃癌發(fā)病有明顯的地域性差別，在我國胃癌高發(fā)的地區(qū)主要集中在東部沿海和中西部的黃河中上游地區(qū)。此外，男女發(fā)病率為2∶1，并且隨年齡的增加而顯著升高。據(jù)我國腫瘤登記中心最新數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果估計，2015年我國胃癌的新發(fā)病例約為67.9萬例，胃癌死亡病例約為49.8萬例^[22]，因此胃癌已是威脅我國居民健康的主要疾病之一。控制進展期胃癌細胞的高侵襲和高轉(zhuǎn)移性是改善患者預后、減少死亡率的有效途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，RPTS可抑制MKN-45細胞增殖、遷移和侵襲。本研究中選用LiCl作為對MKN-45細胞的外源性誘導物，模擬Wnt/β-catenin信號通路被激活情況下對MKN-45細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LiCl處理細胞24 h后，MKN-45細胞中MMP-9、VEGF、COX-2蛋白的表達顯著上調(diào)，但RPTS能逆轉(zhuǎn)以上作用，并表現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴關(guān)系。RPTS對LiCl作用位點GSK-3β蛋白也表現(xiàn)出明顯的調(diào)控作用。

綜上所述，RPTS可抑制MKN-45細胞的遷移和侵襲過程，其機制可能與調(diào)控細胞Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)，但具體調(diào)控機制還需要進一步探索和研究，為更多的臨床應用提供參考。

參考文獻（略） 

來  源：洪星輝，王  靚，梁夢茹，黃金玲. 重樓總皂苷對LiCl誘導人胃癌MKN-45細胞遷移及侵襲的影響 [J]. 中草藥, 2019, 50(13):3134-3139.