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栽培花生(Arachis hypogaea L.)，又稱為花生，是一種重要的豆科植物，全球花生產(chǎn)量超過4398萬噸，其果實可用作食用堅果、做食用油、花生醬、糖果等。中國和印度是兩大花生生產(chǎn)國。 花生中最主要的一種病害是青枯病，是由青枯雷爾氏菌引起的。該病原菌通常感染植物的根部，然后通過維管束傳到地上部分。如果這些細菌繁殖到一定程度，植物就會出現(xiàn)萎蔫癥狀甚至死亡。青枯病是花生生產(chǎn)國中的毀滅性病害，在我國13個主要花生生產(chǎn)省份中已被發(fā)現(xiàn)，并可能造成高達50-100%的產(chǎn)量損失。通過選育具有穩(wěn)定抗性的花生品種是防治青枯病最有效的途徑。通過常規(guī)育種培育了幾十個抗病品種，并廣泛用于花生生產(chǎn)。它們的抗性在植物中是最穩(wěn)定和最持久的。 關于花生抗青枯病的遺傳機制目前了解得很少，通過了解控制性狀的遺傳機制，找到候選基因，可以開發(fā)分子標記，用于基因組輔助育種，將極大地縮短育種時間，培育抗病品種。由于栽培花生(AABB，2n=4x=40)的A、B亞基因組具有很高的相似性，花生基因組大(~2.7Gb)，分子標記多態(tài)性低，因此用傳統(tǒng)分子標記覆蓋整個基因組具有挑戰(zhàn)性大、耗時和勞動強度大等特點。因此需要更有效的策略快速定位抗青枯病的QTL，通過基因組輔助育種(GAB)，加快培育優(yōu)良品種進程。 QTL-seq是一種結合了BSA及高通量測序的方法，能夠快速進行QTL定位。該方法只需要對2個親本及2個子代混池進行測序，具有高效、成本低的特點，已在豌豆、花生、鷹嘴豆等多種物種上得以應用。本研究使用QTL-seq方法對花生青枯病抗性進行了研究。 材 料 由抗病親本Yuanza9102(RP)與感病親本Xuzhou68-4(SP)構建的RIL群體(含195個個體)。用收獲前的存活率評估其抗性。從中選取15個最低存活率的植株(2.15-11.54%)構建感病混池SB；選取存活率最高的15個(92.96%-100%)構建抗病混池。 測 序 對2個親本及2個混池的DNA分別構建了~350bp文庫，采用Illumina NovaSeq 6000進行測序，兩個親本SP、RP測序數(shù)據(jù)分別為82.25Gb、68.99Gb；兩個混池SB、RB的測序數(shù)據(jù)分別為111.7Gb、110.17Gb。 研究結果 01 將reads與親本比對鑒定SNPs 將兩個混池的reads比對到SP的參考序列，抗病、感病混池的覆蓋度為93.15%、93.04%；鑒定到164,522個SNPs；使用RP序列作為參考序列，抗病、感病混池的覆蓋度為93.09%，92.98%；得到243,380個SNPs。 02 抗青枯病的候選區(qū)域鑒定 使用鑒定到的SNP計算了SB、RB的SNP-index，并得到了ΔSNP-index。通過滑窗分析，將SNP-index顯著偏離0.5及ΔSNP-index顯著偏離0的區(qū)域定位為候選區(qū)域。 本研究使用SP序列作為參考序列，在B02染色體上定位到候選區(qū)間，長度為3.35Mb(3.25-6.60Mb)；使用RP序列作為參考序列，定位到了2個候選區(qū)間，分別為B02上的3.25-6.90Mb區(qū)域及B09染色體上13.55-16.40Mb區(qū)間內(nèi)的2.85Mb。 03 通過遺傳圖譜確認鑒定的候選區(qū)域 為了驗證并縮小B02上的候選區(qū)域，對28個ΔSNP-index較高的SNP開發(fā)了KASP標記，用這些標記對RILs群體進行基因分型并構建了遺傳圖譜，圖譜長度為38.14cm。并采用復合區(qū)間作圖法對3個環(huán)境下記錄的表型值進行了QTL定位，LOD值在6.53-17.23，表型解釋率為14.4-29.32%；單標記分析法也證明了3個標記和青枯病抗性存在顯著關聯(lián)。因此，將B02上的候選區(qū)間縮小到了2.07Mb(3.74-5.81Mb)。對B09上的候選區(qū)間開發(fā)了8個KASP標記進行驗證，構建圖譜長度為4.86cm；但復合區(qū)間作圖法及單標記分析法都證明該區(qū)間沒有穩(wěn)定且主效QTL；結合之前基于SSR標記研究鑒定到的5個QTLs,在B09上沒有鑒定到QTL，因此認為B02上的2.07Mb區(qū)域含有抗青枯病的穩(wěn)定的主效QTL，且抗性等位位點來自于Yuanza9102。 圖1 花生中青枯病抗性鑒定的QTL-seq流程 04 青枯病抗性的候選基因 在這2.07Mb區(qū)域中，有348個有效SNPs，其中246個是使用兩個親本做參考序列都能鑒定到的；76、26個分別是用其中一個親本做參考序列鑒定到的；有49個非同義突變SNPs，有19個候選基因。 在這19個發(fā)生非同義突變的基因中有7個能編碼NBS-LRR型的抗性蛋白，包括Araip.G1MIP, Araip.VE4DY, Araip.05JB8, Araip.YCN52, Araip.U0YME, Araip.WF303 和Araip.65IVT。 圖2 鑒定的與青枯病抗性有關的NBS-LRR抗性蛋白 05 診斷標記的驗證 用位于B02上2.07Mb基因組區(qū)域上的3個SNP標記對21個抗病材料和9個感病材料進行驗證(材料由抗病品種Yuanza9102和感病品種Zhonghua5雜交得到)。有2個標記(Araip_B02_3740746 和 Araip_B02_5804063)能夠將抗病材料和感病材料分開。標記Araip_B02_3740746在抗病親本中擴增出來CC等位基因型，在感病親本中擴增出AA等位基因；第二個標記Araip_B02_5804063在抗病親本中擴增出GG等位基因型，在感病親本中擴增出TT等位基因型。所有21個抗病材料都為CCGG基因型，而9個感病材料為AATT基因型。然后對由Yuanza9102與其它兩個抗病親本得到的2個抗病材料進行鑒定，發(fā)現(xiàn)他們都含有CCGG基因型；而對其它的13個感病材料和13個抗病材料進行鑒定，發(fā)現(xiàn)他們都擴增出了AATT基因型。說明來自于Yuanza9102的抗性等位基因可能與其它13個抗性材料的不同。 然后根據(jù)這兩個標記將RILs群體分成了CCGG、AATT基因型的兩類，發(fā)現(xiàn)59個CCGG型的材料的平均存活率為74.45%，要顯著高于78個AATT型的(34.17%)。表明來自Yuanza9102的抗性等位基因能夠顯著提高花生青枯病抗性。通過上述研究，表明Araip_B02_3740746、Araip_B02_5804063這兩個標記對于培育具有青枯病抗性的材料是有用的。 圖3 青枯病抗性診斷標記的驗證 1、使用了2個親本的參考序列對2個混池進行分析，提高了定位的準確性；結合連鎖分析，進一步驗證了定位結果并縮小了候選區(qū)間。 2、成功定位到了青枯病的候選區(qū)域，且開發(fā)了診斷標記，有利于加快花生抗青枯病品種的分子育種。 微分基因是一家借助于國際領先的高通量測序平臺，為生命科學研究和基因檢測提供整體解決方案的高新科技企業(yè)。致力于將生命科學研究和健康管理與疾病診療領域的測序數(shù)據(jù)進行產(chǎn)業(yè)化應用，推動基因科技成果轉化。 2017年3月，微分基因入駐國家大基因中心，成為國家大基因中心“基因檢測平臺”運營企業(yè)，并成立安徽微分基因科技有限公司。8月，位于安徽巢湖的標準潔凈實驗室及醫(yī)學檢驗所啟動運營，占地約2100平方米。10月，全貫穿的基因檢測平臺、大數(shù)據(jù)處理平臺、高通量自動化樣本處理平臺、一流的生物樣本庫開始正式運作。 在生物醫(yī)藥晉升為“ 國家戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)” 的行業(yè)背景下， 微分基因依托獨具優(yōu)勢的高通量基因測序和大數(shù)據(jù)挖掘技術， 為各大高校、醫(yī)院、科研單位以及第三方健康管理服務平臺， 提供專業(yè)的基因檢測和數(shù)據(jù)分析解讀服務。 健康|醫(yī)療|基因|科普 微分基因科技服務 |
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