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“孩兒，你看清楚了沒有？” “看清楚了。” “都記得了沒有？” “已忘記了一小半?！?/p> “也難為你了，再好好想想，現(xiàn)怎樣了？” “已忘記了一大半...”  《倚天屠龍記》中，老張教導(dǎo)小張?bào)w會劍意而忘記劍招的這個片段，其實(shí)是很有深意的，尤其對于生命科學(xué)研究工作者而言。從零開始設(shè)計(jì)一個實(shí)驗(yàn)課題時，我們往往會參考很多的資料，閱讀很多文獻(xiàn)。但是讀過文獻(xiàn)之后，又可能會感覺幫助并不大，由于研究方向、實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹颖绢愋偷鹊鹊牟煌?，文獻(xiàn)中可參考的內(nèi)容不多。 如果屢次出現(xiàn)這種情況，說明你關(guān)注了太多文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)（劍招），而忽視了文章的邏輯架構(gòu)（劍意）。將所有文章都進(jìn)行精讀是效率很低、毫無必要的做法，我們首先需要了解的不是怎么做實(shí)驗(yàn)，而是做什么實(shí)驗(yàn)。 回到miRNA領(lǐng)域中，由于超過1/3的基因都會受到miRNA的調(diào)控，所以miRNA的功能可以說覆蓋了生命體的各個時期、各個過程，每個時期、每個過程都可以進(jìn)行miRNA功能的研究。但是，盡管研究內(nèi)容紛繁復(fù)雜，miRNA功能研究的核心問題是一樣的，就是搞清目的miRNA-靶基因-生物學(xué)功能這三者之間的聯(lián)系。再進(jìn)一步，如果我們將每一篇文獻(xiàn)的內(nèi)容進(jìn)行分解，就會發(fā)現(xiàn)無論哪個方向的miRNA功能研究，都可以大致分為五個模塊。 miRNA功能研究的基本思路 1 尋找研究對象 尋找具有我們感興趣的性質(zhì)的miRNA或蛋白作為研究對象（如：在某樣本中表達(dá)量異常升高或降低）。 2 確認(rèn)研究對象 確認(rèn)研究對象確實(shí)具有我們關(guān)心的性質(zhì)（如：確認(rèn)其表達(dá)量確實(shí)在目的樣本中升高或者降低）。 3 尋找靶關(guān)系 尋找目的miRNA可能與哪些蛋白存在相互作用，或者目的蛋白可能是哪些miRNA的靶蛋白。 4 確認(rèn)靶關(guān)系 確認(rèn)在體內(nèi)這種靶關(guān)系確實(shí)存在，miRNA會降低靶蛋白的表達(dá)量。 5 確認(rèn)生物功能 證明miRNA-靶蛋白這種相互作用關(guān)系會導(dǎo)致什么樣的生物學(xué)功能  圖1. miRNA功能研究基本流程舉例。a，尋找研究對象。通過分化前/分化后的干細(xì)胞miRNA高通量測序結(jié)果，找到維持干細(xì)胞多能性的miRNA候選。b，確認(rèn)研究對象。通過功能分析和qPCR手段，確認(rèn)miR-199b在干細(xì)胞里高表達(dá)，并且過表達(dá)199b有利于干細(xì)胞多能性的維持，確認(rèn)199a為研究對象。c，尋找靶關(guān)系。在199a的預(yù)測結(jié)果中，LCOR及其他兩個基因會在干細(xì)胞里表達(dá)量降低，與199a表達(dá)譜呈負(fù)相關(guān)。d，確認(rèn)靶關(guān)系。通過雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)和western blot等方法，確認(rèn)LCOR是miR-199a的靶蛋白。e，確認(rèn)生物學(xué)功能。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)199a可以通過LCOR降低干細(xì)胞對干擾素刺激的敏感性，維持干細(xì)胞的多能性，調(diào)控乳腺癌的發(fā)生（Celià-Terrassa et al., Nat Cell Biol., 19(6):711-723(2017).） miRNA功能研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 需要注意以下幾點(diǎn) ● 課題設(shè)計(jì)之前，首先需要明確研究的是過程中的哪一點(diǎn)。例如，要進(jìn)行miRNA對肝癌的功能研究，但“肝癌”是非常大的概念，需要精確的清楚課題是針對肝癌中的哪一個通路、哪一個蛋白上，再進(jìn)行課題設(shè)計(jì)。否則，即使通過高通量測序找到了研究對象，依舊無從下手。 ● 尋找研究對象，應(yīng)廣泛閱讀文獻(xiàn)，并且用多種方法分析高通量數(shù)據(jù)。不同的分析會帶來不同的結(jié)果，在不同的結(jié)果中尋找具有特征的研究對象。 ● 確認(rèn)研究對象，應(yīng)采用多角度、多重復(fù)的分析方法。確認(rèn)miRNA表達(dá)量或蛋白表達(dá)量的方法有很多，使用多種方法共同鑒定可以提高結(jié)果的準(zhǔn)確度。研究對象的確認(rèn)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，必須重視。 ● 尋找靶關(guān)系，應(yīng)熟練使用在線的預(yù)測平臺，或生物信息學(xué)的技術(shù)。此外，“miRNA與靶蛋白表達(dá)量相反”這一規(guī)律也有助于在生物信息學(xué)預(yù)測之外找到可能存在的靶關(guān)系。 ● 確認(rèn)靶關(guān)系，與確認(rèn)研究對象相似，應(yīng)采用多種手段共同鑒定。此外，可以通過合理的邏輯推斷找到靶關(guān)系的旁證。比如，對于已證明能夠提高細(xì)胞遷移率的靶蛋白，表達(dá)目的miRNA之后，細(xì)胞遷移率應(yīng)表現(xiàn)為降低。 ● 確認(rèn)生物學(xué)功能是功能研究中最重要的模塊。功能實(shí)驗(yàn)的量、涉及范圍、技術(shù)手段及重要程度是文章意義和影響因子的決定因素。對miRNA-蛋白這種靶關(guān)系導(dǎo)致的生物學(xué)功能應(yīng)運(yùn)用多種方法，邏輯嚴(yán)密的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并可以做適當(dāng)推演和嘗試，考慮靶關(guān)系從長遠(yuǎn)角度或更大范疇上有可能導(dǎo)致什么后果，再加以嘗試。此外，功能研究模塊也是充分使用新技術(shù)、交叉學(xué)科技術(shù)的舞臺。 總之，萬變不離其宗，miRNA功能研究的骨架其實(shí)相當(dāng)簡單，無論是發(fā)育與分化的研究、代謝的研究還是疾病相關(guān)的研究，做好五個模塊的內(nèi)容，一篇miRNA功能研究的文章也就基本成型了。初入miRNA領(lǐng)域時，可以時常找一些miRNA文獻(xiàn)來拆分，可以無關(guān)自身研究，也無需精讀，只要了解文章做了哪些模塊、各個模塊之間是如何聯(lián)系的即可（所謂劍意）。熟悉功能研究的脈絡(luò)之后，再根據(jù)自己的課題方向來找有代表性的文章，研究其實(shí)驗(yàn)所用的方法和操作細(xì)節(jié)（所謂劍招），最后在動手實(shí)驗(yàn)的時候，對課題進(jìn)程就已經(jīng)了然于胸了。 |
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