一、AECs需要特殊處理

第一次分離小鼠肺泡上皮細(xì)胞是很棘手的，肺上皮細(xì)胞周圍有大量的白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞需要分離。更復(fù)雜的是，AECs需要通過分散酶消化而從肺的細(xì)胞外基質(zhì)中釋放出來。分散酶能特異性地裂解存在于AECs基底膜中的IV型膠原蛋白和纖連蛋白，需要通過氣管艱難地注入。

二、區(qū)分肺泡上皮細(xì)胞的類型

肺泡上皮細(xì)胞有兩種類型：I型肺泡上皮細(xì)胞(AECI)和II型肺泡上皮細(xì)胞(AECII)。

AECI很薄，是一種細(xì)長的鱗狀細(xì)胞，主要幫助肺泡和血液之間的氣體交換。AECII是一種小立方形的細(xì)胞，分泌肺表面活性物質(zhì)以降低肺泡表面張力。由于AECII更豐富(大約占ACEs的60%)，它們比AECI更容易分離。因此，大多數(shù)人從肺中分離出初生AECII細(xì)胞，然后對它們進(jìn)行分化，以獲得AECI樣表型。

三、從小鼠肺中分離AECII細(xì)胞

分離肺泡上皮細(xì)胞最著名和廣泛遵循的protocol是由M. Corti和他的同事描述的, 為了達(dá)到高純度，不同的小組對原始協(xié)議進(jìn)行了修改。如下分享一些小技巧，將幫助優(yōu)化您的細(xì)胞分離方法，以獲得那些>90%的純細(xì)胞。

1. 優(yōu)化消化步驟

在肺提取步驟，優(yōu)化肺組織在分散酶的孵育條件，因為它是肺組織成功消化的關(guān)鍵步驟，影響產(chǎn)量。經(jīng)過嘗試，最終優(yōu)化得到最適條件，37℃孵育20 min，在2ml分散酶中連續(xù)旋轉(zhuǎn)。

1. 優(yōu)化上皮細(xì)胞的分離

肺組織消化后，獲得單細(xì)胞懸液。為了從所需的上皮細(xì)胞中分離血細(xì)胞，使用Corti等人推薦的CD45和CD16/32抗體濃度。但Corti研究中提到的磁珠分離系統(tǒng)比較舊，嘗試使用Promega公司的鏈霉親和素包被的磁珠和相應(yīng)的分離柱。這種磁珠分離裝置也可用于純化其他類型的細(xì)胞(如污染白細(xì)胞中的內(nèi)皮細(xì)胞)。

1. 優(yōu)化上皮細(xì)胞的純化

根據(jù)Corti 的protocol, 磁性柱中CD45和CD16/32陰性群體(上皮細(xì)胞)可進(jìn)一步純化，在培養(yǎng)皿中37℃培養(yǎng)4h -16h。很明顯，這種長時間的孵化需要優(yōu)化。

細(xì)胞培養(yǎng)分別采用4h、8h和16h，并監(jiān)測它們的純度。有趣的是，4小時后已經(jīng)用流式細(xì)胞儀觀察到了>90%的純度。雖然較長的培養(yǎng)時間導(dǎo)致相同的純度，但由于上皮細(xì)胞附著在培養(yǎng)皿上，導(dǎo)致產(chǎn)量下降。

1. 細(xì)胞純度的最后檢查

4小時后，細(xì)胞可以從培養(yǎng)皿的上清液中收集。使用Corti等人的協(xié)議，以及概述的優(yōu)化步驟，獲得的AECII細(xì)胞應(yīng)該是高純度的(大約90%)，使用流式細(xì)胞術(shù)通過上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)染色可進(jìn)行檢測。然后，它們可在氣道上皮培養(yǎng)基中37℃下5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)。使用這種特殊培養(yǎng)基的優(yōu)點是它支持生長而不需要添加FBS。含有FBS的培養(yǎng)基可以引起細(xì)胞的自發(fā)激活，在實驗室中是需要避免的。

這些高純度的AECII細(xì)胞可以直接用于實驗，也可以進(jìn)行分化，分化為AECI，通過在5% CO2、37℃，在纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板上培養(yǎng)7天。