作為一種經(jīng)典的實驗技術(shù)，免疫組化（IHC）已成為實驗達(dá)人的必備技能之一。IHC的實驗流程和方法并不難，但在實驗過程中存在許多變量，容易遇到各種問題，因此，想要做出漂亮的實驗結(jié)果并非易事，正所謂“細(xì)節(jié)決定成敗”。下面小編將簡單介紹IHC的相關(guān)知識及在實驗過程中經(jīng)常遇到的問題和應(yīng)對策略，從此，讓成敗與細(xì)節(jié)Say“拜拜”！

那么什么是免疫組化檢測？它的檢測原理是什么？在進(jìn)行深度剖析前，一些重要知識需要了解一下。免疫組化檢測即抗原-抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)以及顯色反應(yīng)。通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、同位素、酶等）顯色來檢測組織切片中的抗原，從而對其進(jìn)行定位、定性和定量。

顯色常用的酶為辣根過氧化物酶（HRP），常用的顯色底物為DAB（3,3’-二氨基聯(lián)苯胺），偶爾用AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）。堿性磷酸酶（AP或AKP）也是目前免疫診斷試劑最常用的標(biāo)記酶之一，穩(wěn)定性好、靈敏度高。

表1. 免疫組化（IHC）顯色系統(tǒng)的選擇

那么，怎樣做出漂亮的染色結(jié)果呢？小伙伴們，莫急！為了有一個全局概念，我們先來看一下石蠟切片免疫組化的實驗流程吧！每一步都存在許多決定成敗的小細(xì)節(jié)，它們可以是陷阱，也可以是獲得好的實驗結(jié)果的基石。

脫蠟水化不充分

脫蠟水化的目的是使組織恢復(fù)到固定后的狀態(tài)，暴露抗原以便與一抗結(jié)合。通常用二甲苯或二甲苯替代物脫蠟，再用乙醇梯度洗脫二甲苯。若脫蠟和水化不全會引起染色不均勻（如下圖）、產(chǎn)生非特異性背景著色等問題。脫蠟不足是免疫組化失敗的最常見原因，原則上要徹底、完全脫去切片上的蠟。

內(nèi)源性過氧化物酶

許多組織中存在內(nèi)源性過氧化物酶，它通過與DAB結(jié)合而著色。在一抗孵育前，一般用3%H2O2滅活約10~20min，避免內(nèi)源性過氧化物酶造成假陽性結(jié)果。H2O2需現(xiàn)用現(xiàn)配，且4℃避光保存，否則易引起非特異背景（如下圖）。H2O2孵育時間過長也會易引起脫片。部分組織還含有內(nèi)源性堿性磷酸酶,可用左旋咪唑進(jìn)行滅活。

抗原修復(fù)

由于組織在甲醛或多聚甲醛固定過程中，會發(fā)生蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而掩蓋抗原決定簇、失去抗原性。通過抗原修復(fù)，可以使細(xì)胞內(nèi)的抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率?？乖迯?fù)技術(shù)通常分為蛋白酶誘導(dǎo)的表位修復(fù)（PIER）和熱誘導(dǎo)的表位修復(fù)（HIER）兩大類。

在PIER方法中，蛋白酶K、胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶等蛋白水解酶可以使隱藏的抗原表位暴露，恢復(fù)其與抗體的結(jié)合。PIER的缺點在于恢復(fù)免疫反應(yīng)性的成功率低，且有可能破壞組織形態(tài)和目的抗原。因此，需要選擇性使用，嚴(yán)格控制濃度和作用時間。

HIER是在脫蠟入水后，將組織切片浸沒在抗原修復(fù)液中并加熱。修復(fù)液的主要成分為檸檬酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、去垢劑和螯合劑。最常用的修復(fù)液為pH 6~10的檸檬酸鹽溶液和EDTA溶液。HIER對時間、溫度、緩沖液和pH特別敏感，精確控制溫度和時間是達(dá)到最佳修復(fù)的關(guān)鍵?？傮w來說，HIER的成功率比PIER高得多。