今天我們繼續(xù)來(lái)聊一聊ImageJ的高階使用技巧。

問(wèn)題三、為什么總是全部圈起來(lái)的灰度值，有沒(méi)有大神指導(dǎo)呢求助！

本問(wèn)題涉及免疫印跡（Western Blot）分析，提問(wèn)者不能分別得到每個(gè)條帶的值。

灰度值0為純黑，255為純白，灰度值與光密度值（OD值）的關(guān)系如下圖所示：

以灰度來(lái)統(tǒng)計(jì)WB條帶的話，無(wú)條帶的純白255左右，條帶越黑著色越深灰度值反而越小，這與我們的認(rèn)知不符。

步驟：

1. File -> Open -> 打開(kāi)需要分析的WB條帶。

2. Image –> Type -> 8-bit, 將圖像轉(zhuǎn)換為8-bit的灰度圖片；Image-> Invert，黑白反轉(zhuǎn)，得到如下圖片：

3. Analyze -> Calibrate, 校正光密度值Function中選擇Uncalibrated OD，左下方Global calibration，勾選表示有多張圖片打開(kāi)時(shí)對(duì)所有圖片進(jìn)行此操作。否則只對(duì)當(dāng)前圖片進(jìn)行此操作。

4. 在工具欄中選擇矩形工具——Rectangular, 最左邊的為矩形工具，選擇條帶：

鍵盤上按數(shù)字1，彈出如下提示框：

點(diǎn)Yes，鍵盤上按數(shù)字3，得到如下：

5.  工具欄中選擇直線工具——Straight，下圖最右邊的為直線工具，按住Shift鍵使用直線工具畫豎線將步驟4的峰進(jìn)行分割：

6.  選擇魔棒工具——Wand tool，分別點(diǎn)擊分割好的峰，即可得到結(jié)果，保存結(jié)果（File -> Save as…）即可：

7. WB統(tǒng)計(jì)分析一般將對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化為100%或1，上述結(jié)果6個(gè)條帶前3個(gè)為對(duì)照組。在Excel中，先計(jì)算對(duì)照組3個(gè)的平均值（AVERAGE(B2:B4)）：

然后所有B列的數(shù)值除以對(duì)照組平均值，此時(shí)對(duì)照組的均值為1：

8. 將所得數(shù)據(jù)放入Graphpad prism繪圖即可：

拓展：

彎曲的WB條帶應(yīng)如何使用ImageJ拉直？

1. 使用Segmented line沿著傾斜條帶畫間斷線段：

2.  雙擊Segmented line，設(shè)置線段的寬度至包含所有條帶：

3. 點(diǎn)擊菜單欄Edit -> Selection-> Straighten，傾斜的WB條帶即可拉直：

問(wèn)題四、如何統(tǒng)計(jì)SEM圖片小球數(shù)量？

步驟：

1. 打開(kāi)ImageJ軟件，F(xiàn)ile -> Open打開(kāi)SEM圖片。Image -> Type將圖片調(diào)整為8-bit。

2. Process -> Enhance Contrast，選擇Normalize，點(diǎn)擊OK：

3. Process -> Find Maxiam，根據(jù)Preview point selection查看Noise tolerance參數(shù)的效果，Output type 選擇Count可得到計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)：

得到結(jié)果共有343個(gè)小球：

問(wèn)題五、怎樣用image J一鍵輸出這張圖上所有的葉片面積，并且是編號(hào)的？

步驟：

1. ImageJ軟件打開(kāi)葉子圖片，Image Type將圖片調(diào)整為8-bit。

2. Image -> Adjust -> Threshold 調(diào)節(jié)閾值，紅色代表選中，使所有葉子均被選中，葉子閾值為0-123。

3. 使用魔棒選中一片看起來(lái)最小的葉子，以此來(lái)評(píng)估葉子的大小范圍。Analyze ->Measure進(jìn)行測(cè)量：

4. Analyze -> Analyze particles。

Size(pixel^2): 默認(rèn)為0-Infinity（無(wú)窮大），意思是需要計(jì)算的細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞大小在哪個(gè)區(qū)間，比如在此葉子大小選擇為 20000-Infinity，將不是計(jì)數(shù)目標(biāo)的雜質(zhì)點(diǎn)過(guò)濾掉，在此我們需要根據(jù)目的細(xì)胞的大小來(lái)試幾個(gè)最小值就能得到準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。

點(diǎn)擊OK，得到每片葉子的編號(hào)、輪廓與面積：

拓展1：

上述得到的Area單位為pixel^2，如何得到其實(shí)際面積？

在未校準(zhǔn)標(biāo)尺的情況下，ImageJ打開(kāi)的圖片為像素（px），標(biāo)尺反應(yīng)的是圖片像素與實(shí)際長(zhǎng)度的比例關(guān)系：

葉子的照片需要在拍照時(shí)放置一個(gè)已知長(zhǎng)度的尺子——標(biāo)尺。

ImageJ添加標(biāo)尺步驟如下：

1. ImageJ軟件打開(kāi)含有標(biāo)尺的葉子圖片：

2. 使用直線工具按住Shift沿著標(biāo)尺畫一條直線：

3. Analyze -> Set Scale：

直線的距離為31pixels，在Known distance（已知距離）填入1cm，Unit of length為cm，Global對(duì)所有后續(xù)打開(kāi)圖片有效，否則只對(duì)當(dāng)前圖片有效，點(diǎn)擊OK。此時(shí)葉子圖片標(biāo)尺為：

4. 后續(xù)分析葉子面積與前述步驟一致，此時(shí)得到的面積單位為cm^2：

拓展2：

如何得到一組葉子的平均面積、標(biāo)準(zhǔn)差信息？

在得到同一圖片內(nèi)數(shù)張葉子面積后，Results ->Distribution，選擇Area：

得到分布結(jié)果：

總共有5個(gè)面積，Mean為2.928，StdDev為1.574，Min為0.938，最大值為4.655……。

當(dāng)然，Results ->Summarize也可以得到上述信息：

今天給大家分享ImageJ的使用就到此為止，希望對(duì)大家有所幫助！