在一系列的基因組編輯工具中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)因簡單易用而廣受人們歡迎。盡管這是一種強(qiáng)大的工具，但基因組編輯實驗的實際效果會受到各種參數(shù)和生物學(xué)因素的影響。為此，比利時布魯塞爾自由大學(xué)的研究人員在最新一期的《BioTechniques》上提出了優(yōu)化CRISPR/Cas9實驗的指南和工具。

目標(biāo)位點的選擇

研究人員認(rèn)為，認(rèn)真確定目標(biāo)位置是至關(guān)重要的。對于許多應(yīng)用而言，功能喪失（loss-of-function）分析必不可少。常規(guī)的策略是利用sgRNA將Cas9核酸酶引導(dǎo)到蛋白質(zhì)編碼基因的N端外顯子。在Cas9核酸酶的作用下，通過容易出錯的非同源末端連接（NHEJ）來修復(fù)雙鏈斷裂，從而引入移碼突變和提前終止密碼子。

CRISPR誘導(dǎo)突變的高效率讓基因敲除變得很輕松。然而，在靶向細(xì)胞必需的基因時，這卻成了一個問題。之前，兩項不同的全基因組CRISPR篩選已經(jīng)確定人類基因組中大約有2000個必需基因。最近，Lenoir等人發(fā)布了一個數(shù)據(jù)庫，可以從中搜索到不同人體組織中的必需基因。

因此，在研究功能喪失時，RNAi或CRISPRi已成為有效的替代研究方法，它們的效果可通過轉(zhuǎn)錄組水平的分析來直接評估。同時，誘導(dǎo)型的CRISPR工具實現(xiàn)了時間嚴(yán)格控制的基因組編輯。

作者還建議仔細(xì)評估目標(biāo)區(qū)域的遺傳多態(tài)性，因為它可能對CRISPR/Cas9的效果產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。盡管sgRNA與目標(biāo)序列之間允許存在五個以內(nèi)的堿基錯配，但PAM及其附近序列對序列一致型有著更嚴(yán)格的要求。在選擇sgRNA時，應(yīng)當(dāng)驗證PAM和sgRNA結(jié)合位點是否存在SNP，因為這會影響Cas9的結(jié)合和切割。

值得注意的是，實驗室中常用細(xì)胞系的DNA序列可能不完全對應(yīng)于基因組數(shù)據(jù)庫中的序列。在設(shè)計sgRNA之前，對目標(biāo)位點進(jìn)行測序可解決這一潛在的問題。細(xì)胞系倍性也是需要考慮的因素。許多癌細(xì)胞系攜帶四條或更多的染色體拷貝。完全敲除需要在目標(biāo)基因的所有拷貝上引入突變。在產(chǎn)生突變克隆細(xì)胞系時，強(qiáng)烈建議對目標(biāo)基因座進(jìn)行測序，以確認(rèn)純合性敲除。

此外，染色質(zhì)的狀態(tài)也大大影響Cas9結(jié)合和核酸酶活性。核小體的定位直接阻礙Cas9在體內(nèi)和體外的結(jié)合和切割。染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)也會影響Cas9結(jié)合和酶活。一些研究表明Cas9切割效率與開放染色質(zhì)呈正相關(guān)。雖然一些基因編輯應(yīng)用程序可以選擇易于切割的目標(biāo)，但這種做法顯然不適用于基因修復(fù)及其他的治療應(yīng)用。

模式生物的基因靶向為人們帶來了更多的挑戰(zhàn)，因為染色質(zhì)景觀在不斷變化，以確保早期發(fā)育過程中的生長和分化。作者認(rèn)為，轉(zhuǎn)錄組圖譜（RNA-Seq）和染色質(zhì)開放性圖譜（ATAC-Seq和ChIP-Seq）是很有用的資源，可以預(yù)測sgRNA的效率。全基因組小鼠（Brie）和人類（ Brunello）文庫的發(fā)表極大地促進(jìn)了小鼠和人類細(xì)胞的基因編輯。

導(dǎo)入方法

將CRISPR/Cas9組分導(dǎo)入細(xì)胞通常是利用DNA導(dǎo)入系統(tǒng)來實現(xiàn)的，比如將編碼Cas9和sgRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)。病毒顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)也是一種常用方法，往往比質(zhì)粒轉(zhuǎn)染更有效，適用于包括原代細(xì)胞在內(nèi)的許多種細(xì)胞。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)分別實現(xiàn)了Cas9的瞬時表達(dá)和永久表達(dá)。當(dāng)然，Cas9的長時間表達(dá)會導(dǎo)致脫靶事件的積累。因此，人們試圖控制Cas9和sgRNA的表達(dá)時間，以便降低脫靶效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)力霉素（doxycycline）誘導(dǎo)的啟動子可實現(xiàn)Cas9的瞬時表達(dá)，并且與慢病毒載體兼容。

若擔(dān)心質(zhì)粒整合的問題，可以使用Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物來實現(xiàn)基因編輯。Cas9 RNP復(fù)合物可自行制備，或從各個供應(yīng)商處購買。RNP復(fù)合物的導(dǎo)入方法也有很多種，比如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射等。對于植物細(xì)胞而言，用基因槍導(dǎo)入Cas9 RNP復(fù)合物或編碼Cas9和sgRNA的質(zhì)粒似乎是一種不錯的方法。

研究發(fā)現(xiàn)，RNP復(fù)合物在導(dǎo)入12至24小時內(nèi)切割染色體DNA，而基因編輯的頻率在1天后到達(dá)平臺期。若采用質(zhì)粒來表達(dá)Cas9和sgRNA，在導(dǎo)入3天后才能達(dá)到相同的基因編輯水平。此外，Cas9蛋白在24至48小時內(nèi)迅速降解，而質(zhì)?？蛇B續(xù)表達(dá)幾天。因此，RNP復(fù)合物的使用可減少脫靶效應(yīng)。

RNP復(fù)合物的另一個優(yōu)點是適用于各種模式生物和細(xì)胞類型。研究發(fā)現(xiàn)，對體內(nèi)環(huán)境而言，Cas9/sgRNA RNP復(fù)合物的功能優(yōu)于其他導(dǎo)入方法。以斑馬魚研究為例，人們將編碼Cas9的mRNA或Cas9蛋白連同sgRNA一起顯微注射到受精胚胎中進(jìn)行誘變。與編碼Cas9的mRNA相比，RNP復(fù)合物在顯微注射后立即起作用。若是導(dǎo)入mRNA，還要考慮密碼子優(yōu)化的問題。

在利用慢病毒或質(zhì)粒導(dǎo)入Cas9和sgRNA時，通常利用抗性標(biāo)記（潮霉素或嘌呤霉素）或報告基因（GFP）來分離成功轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染RNP復(fù)合物時可使用替代報告基因（surrogate reporter）。熒光形式的Cas9（比如Cas9-GFP或Cas9-Cy3）可用來分選RNP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

向?qū)NA的效率和特異性

對于同一基因而言，不同sgRNA的表現(xiàn)也許千差萬別。目前有許多生物信息學(xué)工具可用來設(shè)計sgRNA，其中一些工具可對sgRNA進(jìn)行打分。不過，沒有一種工具可以保證sgRNA的效果，因此在可能的情況下，盡量測試多個sgRNA，并利用核酸內(nèi)切酶切割實驗來鑒定sgRNA在體外的切割效果。當(dāng)然，這不能保證體內(nèi)有效性，因為還取決于染色質(zhì)開放性。

Cas9的靶向特異性取決于20 nt的sgRNA向?qū)蛄幸约盎蚪M中與目標(biāo)序列相鄰的PAM的存在。值得注意的是，將sgRNA向?qū)蛄锌s短至17 nt，可明顯提高靶向特異性。許多在線工具可以輔助sgRNA的設(shè)計，但預(yù)測效果和實際效果往往有很大差異，因為光憑序列同源性不能完全預(yù)測脫靶位點。

理論上來說，對編輯前后的細(xì)胞進(jìn)行全基因組測序（WGS）分析可無偏向地檢測脫靶。不過，WGS本身也面臨挑戰(zhàn)，可能不適用于脫靶突變的檢測。盡管測序成本不斷下降，但人們需要一定程度的生物信息學(xué)知識來檢測小的插入缺失，并將信號和噪聲區(qū)分開。此外，克隆擴(kuò)增期間也可能出現(xiàn)許多自發(fā)的新突變，無法與脫靶效應(yīng)區(qū)分。

為了克服這些限制，人們最近開發(fā)了幾種方法來檢測基因組中Cas9的脫靶活性，比如BLESS（標(biāo)記DSB后富集和測序）、HTGTS（高通量的全基因組易位測序）、GUIDE-Seq（通過測序?qū)崿F(xiàn)全基因組內(nèi)DSB的無偏向鑒定）、Digenome-Seq（體外Cas9消化的WGS）、IDLV（利用整合酶缺陷型慢病毒載體檢測脫靶）以及最近的SITE-Seq（鑒定DNA切割位點的生化方法）和CIRCLE-Seq（體外鑒定脫靶突變的方法）等。

染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）是研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的首選技術(shù)。因此，您可以通過ChIP-qPCR來評估dCas9在目標(biāo)區(qū)域的特異性富集，同時還可以將這種方法擴(kuò)展到ChIP-Seq，實現(xiàn)無偏向的脫靶位點分析。作者認(rèn)為，基于dCas9的ChIP-PCR/Seq是一種強(qiáng)大的方法，能夠快速經(jīng)濟(jì)地評估幾條sgRNA。不過，沒有一種方法能保證完全覆蓋脫靶位點，因此理想的方案是結(jié)合使用多種方法。

展望未來

作者認(rèn)為，若要將Cas9應(yīng)用于基因治療，必須要解決幾個問題。首先，Cas9核酸酶通常來源于常見的人類病原體。最近的報道稱人群對SpCas9和SaCas9已經(jīng)有免疫力。如何控制Cas9引起的免疫應(yīng)答，這是一個問題。其次，另一個限制是Cas9比較大，無法包裝到腺相關(guān)病毒載體中，可以考慮Cas9核酸酶家族的其他成員，比如Cas12a（Cpf1）。此外，Cas13a和CasRx也為基于RNA編輯的新療法鋪平了道路。