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本文由艾奧利亞編譯，瑪莉、江舜堯編輯。 原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載。 微生物菌群和腸上皮通過營養(yǎng)的快速消耗限制了病原體的生長。本研究探究了病原菌是如何繞過這一障礙在宿主上進(jìn)行定居。以腸道致病性大腸桿菌（EPEC）作為研究對象發(fā)現(xiàn)，附著著的細(xì)菌可以從感染的宿主細(xì)胞中獲取營養(yǎng)，這一過程我們稱之為宿主營養(yǎng)提取（HNE）。我們確定了一個對HNE來說充分且必要的內(nèi)膜蛋白復(fù)合體（以下稱為CORE），該復(fù)合體是EPEC注射體的關(guān)鍵部件。本研究證明，其支持形成一種由膜納米管組成，從EPEC表面凸出，直接與宿主接觸的替代結(jié)構(gòu)。注射體和鞭毛在進(jìn)化上是相關(guān)的，都含有保守的COREs?；谘芯拷Y(jié)果，我們支持這樣一種觀點，即HNE是一種廣泛的致病力策略，使病原體能夠在競爭激烈的生態(tài)位中茁壯成長。 論文ID 原名：Pathogenic E. coli Extracts Nutrients from Infected Host Cells Utilizing Injectisome Components 譯名：致病性大腸桿菌利用注射性成分從感染宿主細(xì)胞中提取營養(yǎng)物質(zhì) 期刊：Cell IF：31.398 發(fā)表時間：2019年 通信作者：Sigal Ben-Yehuda；Ilan Rosenshine 通信作者單位：希伯來大學(xué)（The Hebrew University of Jerusalem） 實驗結(jié)果 1 宿主附著的EPEC消耗宿主衍生的氨基酸 考慮到EPEC與宿主細(xì)胞的緊密結(jié)合，我們假設(shè)EPEC可能通過從受感染的宿主細(xì)胞中吸取營養(yǎng)物質(zhì)來克服自身的營養(yǎng)限制。為了驗證這一假設(shè)，我們比較了游離的EPEC和被宿主附著的EPEC在缺乏氨基酸的情況下（饑餓情況）合成蛋白質(zhì)的能力。為了達(dá)到這一目的，我們構(gòu)建了一個缺少△proC的EPEC突變體，該突變體含有一個蛋白質(zhì)合成的報告基因，該基因可以在異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的PTAC啟動子下表達(dá)產(chǎn)生綠色熒光蛋白(GFP)?；谘芯课覀儼l(fā)現(xiàn)，當(dāng)EPEC從豐富的培養(yǎng)基環(huán)境轉(zhuǎn)移到缺少氨基酸或者最低濃度培養(yǎng)基環(huán)境時，將不再產(chǎn)生GFP。隨后，設(shè)計了一種饑餓條件下感染EPEC △proC的實驗（圖1A），即在豐富的培養(yǎng)基中先進(jìn)行感染，允許毒力因子的表達(dá)和宿主的附著，然后在無氨基酸的饑餓培養(yǎng)基中孵育以耗盡細(xì)菌的氨基酸庫。之后添加IPTG誘導(dǎo)GFP表達(dá)，固定感染的細(xì)胞，并進(jìn)行熒光顯微鏡分析；與此同時對未附著的細(xì)菌進(jìn)行檢測。通過實驗發(fā)現(xiàn)，沒有附著的細(xì)菌產(chǎn)生GFP受到抑制，但附著的細(xì)菌表達(dá)GFP水平較高，盡管野生型具有合成所有氨基酸的潛力，但當(dāng)使用野生型EPEC代替△proC突變體時，同樣得到類似的結(jié)果（圖1C-E）。以上數(shù)據(jù)表明附著的EPEC具有從宿主細(xì)胞中獲得氨基酸并利用它們來合成蛋白質(zhì)的能力，我們稱這種能力為宿主營養(yǎng)提取（HNE）。 圖1 EPEC從感染宿主細(xì)胞中吸收氨基酸和Calcein。a表示氨基酸吸收試驗；b-c表示氨基酸攝取量的量化；d-e表示氨基酸攝取實驗的代表性圖像；f表示EPEC從感染宿主細(xì)胞中獲得Calcein；g表示Calcein攝取量的量化。 2 Calcein從宿主細(xì)胞質(zhì)遷移到附著的EPEC的細(xì)胞質(zhì)中 上述結(jié)果說明，氨基酸等小分子物質(zhì)可以從宿主細(xì)胞遷移到感染的EPEC中。為了檢驗這種可能性，我們檢測了該細(xì)菌從宿主中獲得小分子熒光示蹤劑鈣黃綠素(Calcein)(分子量為0.62 kDa)的能力。HeLa細(xì)胞和能夠進(jìn)入細(xì)胞的非熒光乙酰甲氧基鈣調(diào)素(Calcein-AM)共培養(yǎng)。當(dāng)Calcein-AM進(jìn)入細(xì)胞后，其AM基團(tuán)被細(xì)胞內(nèi)的酯酶去除，游離的Calcein保留在細(xì)胞質(zhì)中并顯熒光。而與HeLa細(xì)胞不同的是，EPEC缺乏能夠水解AM基團(tuán)的酯酶。隨后，用細(xì)菌侵染含有Calcein的HeLa細(xì)胞（無論饑餓與否，均選擇饑餓條件下進(jìn)行）。由于含有Calcein的HeLa細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號，從而影響了對原位感染細(xì)菌的分析。因此，我們分離了游離的非附著的細(xì)菌，同時對宿主細(xì)胞進(jìn)行裂解，分別回收游離的非附著的細(xì)菌以及附著宿主的EPEC?；跓晒怙@微鏡對這兩個群體進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，被宿主附著的細(xì)菌獲得了Calcein，由于饑餓條件可以加劇這一現(xiàn)象(圖1F、1G)。這些結(jié)果提示HNE可能是由一種分子間的流動所介導(dǎo)的，即從宿主細(xì)胞質(zhì)分子到依附的EPEC中去。 3 HNE允許附著的EPEC在饑餓條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的從頭合成 為了進(jìn)一步證實HNE的存在，基于細(xì)菌對氨基酸饑餓的響應(yīng)，我們設(shè)計了一種額外的檢測方法。該方法利用一個低拷貝數(shù)質(zhì)粒(pSC101*)，表達(dá)一種由啟動子(P1rrsB)驅(qū)動的不穩(wěn)定的GFP(GFPtm)，當(dāng)嚴(yán)格的反應(yīng)激活時，GFPtm受到嚴(yán)格的抑制（圖2A）。我們預(yù)測在饑餓狀態(tài)下，被宿主附著的EPEC可以執(zhí)行HNE并維持較高的GFPtm水平，而非附著的細(xì)菌則表現(xiàn)出抑制GFPtm的產(chǎn)生。為了驗證這一想法，我們用含有GFPtm報告基因的EPEC在富集培養(yǎng)基中侵染HeLa細(xì)胞，然后將感染的細(xì)胞在饑餓培養(yǎng)基中培養(yǎng)、固定并在熒光顯微鏡下觀察。研究結(jié)果表明，在非附著細(xì)菌中的GFPtm水平迅速下降，而在附著宿主的細(xì)菌中合成了GFPtm，并積累到較高水平（圖2B-C）。這一現(xiàn)象表明，被附著的EPEC能夠在饑餓狀態(tài)下進(jìn)行蛋白質(zhì)的從頭合成。為了研究GFPtm在宿主附著細(xì)菌中的積累是否源于蛋白質(zhì)的從頭合成，我們用時間間隔顯微鏡觀察了單個EPEC細(xì)菌中GFPtm的合成。結(jié)果表明，在饑餓期間，最新附著在宿主上的EPEC累積了GFPtm，表明這些細(xì)菌進(jìn)行了新的GFPtm的從頭合成（圖2D）。為了進(jìn)一步證實這一假設(shè)，我們在光脫色(FRAP)之后對熒光進(jìn)行了檢測，以探究被附著的 EPEC是否保持了GFPtm的合成能力，而呈現(xiàn)綠色。基于顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，光脫色后的EPEC在一段時間后恢復(fù)了熒光，進(jìn)一步驗證了新的GFPtm合成(圖2E)。 圖2 HNE允許附著的EPEC在饑餓條件下進(jìn)行蛋白的從頭合成。a代表從P1rrsBGFPtm報告基因的GFPtm表達(dá)量；b代表用含有P1rrsBGFPtm報告基因的EPEC在DMEM條件下侵染HeLa細(xì)胞3h；c代表GFPtm表達(dá)量的量化；d表示用時間間隔熒光顯微鏡記錄了饑餓條件下GFPtm在最新寄主附著的EPEC細(xì)胞內(nèi)的積累情況(用圓圈表示)；e表示時間間隔顯微鏡的FRAP分析。 4 宿主營養(yǎng)物提取（HNE）需要腸細(xì)胞脫落位點（LEE） 為了探討HNE是否是附著的病原菌的共同特性，基于P1rrsB-GFPtm報告基因檢測了幾株EPEC臨床分離株的HNE能力。同時，我們以三株大腸桿菌K12的實驗菌株為研究對象，輔以粘附素編碼基因（以促進(jìn)宿主的粘附），對HNE活性進(jìn)行評估。所有被檢測的EPEC分離株都可執(zhí)行HNE，而在被宿主附著的E.coli K12菌株并未發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果(圖3B)?；谝陨辖Y(jié)果，EPEC獨特的表面成分促進(jìn)了HNE。為了鑒定這一推測，我們采用缺乏表面特有成分的EPEC的突變體侵染上皮細(xì)胞。結(jié)果表明，僅有缺乏LEE區(qū)域的突變體△LEE在執(zhí)行HNE方面有缺陷(圖3A)，這說明LEE編碼了該過程所需的元素。此外，我們在E.coli K12菌株中添加全部的EPEC LEE (pLEE)粘粒，以此菌株去侵染腸上皮細(xì)胞。通過實驗可以發(fā)現(xiàn)，被宿主附著的E.coli K12/pLEE表現(xiàn)出GFPtm的高水平積累，說明其具有很強(qiáng)的HNE活性(圖3B)?；谝陨辖Y(jié)果，我們有理由認(rèn)為LEE所包含基因?qū)?/span>HNE來說是必要且充足的。 圖3 宿主營養(yǎng)物提?。?/span>HNE）需要腸細(xì)胞脫落位點（LEE）。a表示用野生型EPEC和缺少LEE區(qū)域的突變體△LEE去侵染HeLa細(xì)胞，這兩種細(xì)菌均含有P1rrsB-GFPtm報告基因；b表示用含有P1rrsB-GFPtm報告基因的E.coli K12菌株W3110和含有LEE質(zhì)粒的E.coli K12（K12/pLEE）侵染HeLa細(xì)胞3h。 5 CORE基因?qū)?/span>HNE是必不可少的 為了探究HNE是否需要LEE基因，我們通過大量缺少編碼注射組分的基因突變體來檢測HNE的活性。這其中包括轉(zhuǎn)運子組分（espA，espB，espD），外膜環(huán)蛋白（escC），內(nèi)膜環(huán)蛋白組件(escJ，escD)，分泌型開關(guān)蛋白(sepL，sepD)和CORE蛋白(escRSTU，escV)。雖然上述每一個突變體都缺乏注射性，但除了escRSTUV突變體外，所有的突變體仍然能夠執(zhí)行HNE（圖4A）?；跇?gòu)建的EPEC菌株（稱為△LEE:CORE，該菌株攜帶由LEE1原生啟動子操作表達(dá)的特定的染色體escRSTUV操縱子，但缺少所有其他的LEE基因）(圖4A)，我們發(fā)現(xiàn)，EPEC △LEE:CORE表現(xiàn)出高效的HNE(圖4B)，這表明功能CORE是這一過程所必需且充足的。此外，添加pCORE-IEPEC的E.coli K12恢復(fù)了具有了執(zhí)行HNE的能力(圖4B)。這些結(jié)果強(qiáng)化了這樣一個前提，即CORE是促進(jìn)HNE所必需的。因此，除了其注射功能的任務(wù)外，CORE蛋白可能具有完全意想不到的、以前未被報道的作用，作為從受感染的宿主細(xì)胞獲取營養(yǎng)的裝置。 圖4 CORE基因?qū)?/span>HNE是必不可少的。a表示LEE組成成分，每個基因由一個箭頭表示，相應(yīng)的基因名稱在下方表示；b表示用含有P1rrsB-GFPtm報告基因的細(xì)菌侵染Hela細(xì)胞3h隨后饑餓條件下處理1h。 6 CORE基因表達(dá)誘導(dǎo)膜狀納米管的形成 CORE蛋白形成一個內(nèi)膜復(fù)合體；然而，我們預(yù)測HNE需要一個跨越細(xì)菌包膜的結(jié)構(gòu)，向外延伸到宿主細(xì)胞表面。為了檢測與CORE基因表達(dá)相關(guān)的結(jié)構(gòu)，通過對△LEE:CORE和△LEE菌株進(jìn)行對比（均去除了形成鞭毛和BFP的能力），基于高分辨率掃描電鏡(XHR-SEM)分析發(fā)現(xiàn)，從細(xì)菌表面不同位置延伸出來的管狀突起在△LEE:CORE菌株中很容易被發(fā)現(xiàn)（圖5A），同時，這些突起的形成在營養(yǎng)缺乏時得到加強(qiáng)。為了確定這些凸起是否具有與B. subtilis相似的膜特點，基于膜染料對△LEE:CORE和△LEE菌株進(jìn)行了熒光顯微鏡觀察，通過觀察發(fā)現(xiàn)，被熒光膜染料染色的延伸結(jié)構(gòu)是由△LEE:CORE產(chǎn)生的（圖5B）。此外，基于免疫XHR-SEM對未包被的樣品進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn)，延伸的突起很大程度的被抗體修飾，說明這些延伸部分含有脂多糖（LPS）（圖5C）。綜上所述，我們的結(jié)果證實了CORE表達(dá)促進(jìn)膜狀納米管形成的觀點。 圖5 CORE基因表達(dá)誘導(dǎo)膜狀納米管的形成。a表示缺少鞭毛和BFP的△LEE:CORE和△LEE兩種菌株接種到EM網(wǎng)格上，放置于DMEM瓊脂平板上3h，然后轉(zhuǎn)移到饑餓培養(yǎng)基瓊脂平板上；b表示缺少鞭毛和BFP的EPEC △LEE:CORE在DMEM培養(yǎng)基上生長然后在饑餓培養(yǎng)基中孵育1h；c表示缺少鞭毛和BFP的EPEC △LEE:CORE在DMEM培養(yǎng)基上生長，然后放置在圓形玻璃上，固定，用兔抗O 127抗血清標(biāo)記，然后用金共軛的山羊抗兔抗血清標(biāo)記；d表示缺少鞭毛和BFP同時輔以一個編碼侵襲素的質(zhì)粒的△LEE:CORE和△LEE兩種菌株，分別感染HeLa細(xì)胞3h后饑餓1h；e表示缺少鞭毛和BFP但帶有GFP標(biāo)記的△LEE:CORE和△LEE兩種菌株分別感染HeLa細(xì)胞3h后饑餓1h；f中侵染細(xì)胞方式同e中相同，時候回收游離的細(xì)菌，進(jìn)行現(xiàn)場稀釋試驗，同時，被感染的細(xì)胞被清洗以去除未附著的細(xì)菌，并溶解以釋放附著的細(xì)菌；g表示按照d中的步驟用△LEE:CORE菌株侵染HeLa細(xì)胞，用抗O127抗體標(biāo)記。 7 在EPEC與受感染宿主細(xì)胞之間形成CORE依賴性的納米管橋 HNE是由納米管突出物介導(dǎo)的假說說明納米管可以將EPEC連接到受感染的宿主細(xì)胞上。對感染EPEC △LEE:CORE和EPEC △LEE的細(xì)胞進(jìn)行XHR-SEM分析發(fā)現(xiàn)，EPEC △LEE:CORE能有效地附著在宿主上，而缺少CORE的細(xì)菌很少與宿主表面結(jié)合（圖5D）。熒光顯微鏡和宿主相關(guān)群落的形成進(jìn)一步證實了粘附效率的顯著差異（圖5E-F）。這些觀察表明，CORE有助于EPEC與宿主之間的連接。基于XHR-SEM進(jìn)一步探究與宿主結(jié)合的EPEC △LEE:CORE發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)菌凸起出的納米管狀可以將它們很好的固定在宿主膜上（圖5D）。因此，我們的數(shù)據(jù)顯示，依賴于CORE的納米管橋鏈接了細(xì)菌和感染的宿主細(xì)胞，這意味著納米管促進(jìn)HNE過程。 8 缺乏CORE表達(dá)的細(xì)菌不能通過近端可表達(dá)CORE的細(xì)菌來執(zhí)行HNE作用 HNE可能通過依賴于CORE的納米管直接從宿主細(xì)胞質(zhì)中提取氨基酸，除此之外，還可能以一種CORE依賴的方式通過消耗釋放到宿主表面的營養(yǎng)物質(zhì)來促進(jìn)HNE的產(chǎn)生。為了區(qū)別這兩種方式，我們用△LEE和△LEE:CORE按1：1混合后去感染HeLa細(xì)胞，在不考慮納米管的生成與否的情況下，這兩種細(xì)菌都可表達(dá)BFP以確保平等的宿主附著的能力(圖6A)。為了同時檢測這些菌株的HNE，采用兩種不同的受體對HNE進(jìn)行標(biāo)記，一個基于GFP，另一個基于mCherry。分析表明，僅有CORE表達(dá)的EPEC具有HNE的能力，而位于其周圍的△LEE細(xì)菌仍然缺乏HNE的能力(圖6B和6C)。這些結(jié)果表明，缺乏CORE表達(dá)的細(xì)菌不能通過較近可表達(dá)CORE的細(xì)菌來執(zhí)行HNE作用。因此，HNE極不可能涉及到宿主釋放營養(yǎng)物質(zhì)的消耗。 圖6 HNE完全由CORE表達(dá)介導(dǎo)并與注射活性相關(guān)。a表示缺少鞭毛和BFP的△LEE:CORE和△LEE兩種菌株侵染Hela細(xì)胞3h，然后饑餓1h，固定，鍍金，用XHR-SEM進(jìn)行分析；b-c表示△LEE:CORE和△LEE兩種菌株按照1：1比例混合侵染Hela細(xì)胞；d代表用含有P1rrsB-mCherry-tm報告基因的EPEC感染HeLa細(xì)胞3h，以表示HNE過程(紅色熒光)和nleA-gfp報告基因用于監(jiān)測注射激活，從而導(dǎo)致效應(yīng)器注射。 9 一個單獨的EPEC細(xì)菌可以與效應(yīng)劑注射一起執(zhí)行HNE 感染EPEC執(zhí)行兩個CORE依賴的活動：與納米管相關(guān)的HNE和由注射體介導(dǎo)的注入效應(yīng)蛋白。這意味著，每個EPEC細(xì)菌要么同時執(zhí)行這兩種活動要么執(zhí)行其中之一。為了區(qū)分這兩種情況，我們使用含有兩個不同受體的EPEC菌株去侵染宿主細(xì)胞，這兩個受體分別是可以用來監(jiān)測HNE的P1rrsB-mCherry-tm，以及用于監(jiān)測注射體活性的nleA-gfp。我們觀察到所有顯示注射體活性的細(xì)菌(即GFP表達(dá)的細(xì)菌)也都可以執(zhí)行HNE(圖6D)。盡管如此，我們可以很容易地確定宿主連接的EPEC執(zhí)行了HNE能力，但缺乏注射性激活的信號(圖6D)。因此我們得出結(jié)論，大多數(shù)細(xì)菌的HNE過程和效應(yīng)器注射是同時進(jìn)行的。 10 不同譜系的CORE復(fù)合物支持了可執(zhí)行HNE的EPEC △LEE突變體 考慮到核心成分的高度保守性，我們提出問題：執(zhí)行HNE的能力是EPEC注射體CORE(CORE-IEPEC)的一個獨特特征，還是來自不同譜系的CORE復(fù)合體的共同特征?；谝陨蠁栴}，我們探究了不同CORE恢復(fù)EPEC △LEE突變體HNE活性的能力。通過構(gòu)建兩種不同的質(zhì)粒CORE-ISPI-1和CORE-ISPI-2（兩種毒力必要因子），基于實驗發(fā)現(xiàn)，CORE-ISPI-1和CORE-ISPI-2都可以恢復(fù)EPEC △LEE執(zhí)行HNE的能力(圖7），表明這一過程并不是CORE-IEPEC特有的。接下來，我們對EPEC(CORE-FEPEC)和E.coli K12(CORE-FK12)的鞭毛核心基因(即fliPQR、flhBA)進(jìn)行了檢測發(fā)現(xiàn)，兩者都能通過EPEC △LEE恢復(fù)HNE，其方式依賴于flio，一種編碼鞭毛核心組裝所需的伴侶（圖7）。其次，我們探究了一個更遙遠(yuǎn)的CORE復(fù)合體，它來自革蘭氏陽性細(xì)菌B.subtilis的鞭毛。在EPEC △LEE作用下，B.subtilis的CORE復(fù)合體(包括flio)顯著地刺激了HNE的執(zhí)行（圖7）。在所附的論文中，我們發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)菌利用其內(nèi)源鞭毛核心復(fù)合物形成細(xì)胞間納米管。綜上所述，這些結(jié)果表明，不同的注射體和鞭毛的CORE支持HNE與納米管的形成，突出了CORE的雙重功能，可以作為革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌的一個鞭毛或注射性載體潛在的共同屬性。
圖7 不同譜系的CORE復(fù)合物支持了可執(zhí)行HNE的EPEC △LEE突變體。
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