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摘要 Western Blot中內(nèi)參的使用時不可缺少的，內(nèi)參的選擇、使用都關系到wb實驗結(jié)果的準確性，那么需要童鞋們對內(nèi)參有透徹的認知，今天老司機在這里講講選擇內(nèi)參的必要性、內(nèi)參的選擇原則以及使用方法。供廣大科研朋友參考借鑒。 內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal Control），對于哺乳動物細胞來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白（Housekeeping Proteins），它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。
一、為什么要使用內(nèi)參呢？ Western blot除了能證明某樣品含有某種蛋白之外，其最為重要的作用是比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少。即為蛋白表達水平最直接的證據(jù)。要衡量蛋白的表達水平，前提條件就是等量的上樣量。 然而如果僅將蛋白濃度測定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法，顯然是不可取的。 首先各種蛋白質(zhì)濃度定量方法都存在局限性，不能完全準確的確定各種樣品的蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)，相對于比色法來說，操作簡單，但是容易受到平行物質(zhì)如DNA的干擾，且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測定蛋白濃度一般有BCA、Bradford、Lowry等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford法敏感度最高，且與一些列干擾Lowry、BCA反應的還原劑（如DTT、巰基乙醇）相溶，但是對去污劑依然是敏感的，其最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。另外，蛋白質(zhì)定量以后進行電泳時需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Western Blot實驗時使用內(nèi)參，即可簡便地對定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進行校正。 在Western Blot中使用內(nèi)參其實就是在WB過程中另外用內(nèi)參對應的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達，由于內(nèi)參在各組織和細胞中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。
二、如何選擇合適的內(nèi)參呢？ 有些人提取蛋白會選擇胞漿、胞核分開提取，不提取總蛋白。β-actin在胞漿中表達高效穩(wěn)定，而總蛋白主要成分就是胞漿蛋白，所以β-actin可以作為總蛋白的內(nèi)參。理論上細胞核內(nèi)不表達β-actin，所以不能用于核蛋白內(nèi)參。同理，細胞核內(nèi)的蛋白用于做總蛋白內(nèi)參，自然也不合理，內(nèi)參自當選擇與目的蛋白表達部位相同的蛋白才能有說服力。 而實際情況中，無論什么試劑盒，都不可能完全將胞漿、胞核蛋白完全分離開，提取時總會有交叉污染。即提取的核蛋白肯定會有β-actin，而胞漿蛋白也會有核蛋白的存在，所以你用兩種蛋白做內(nèi)參都能有結(jié)果，只是有的科學合理，有的不科學，沒有說服力。 此外很多公司的內(nèi)參抗體是用抗原片段制備的，不同的公司選擇的片段不一樣。以最常用的β-actin為例，有的公司選擇N端，有的選擇C端。選用N端的抗體均不能檢測心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用C端的抗體可以在肌肉細胞中檢測到actin陽性信號。有時候在實驗中檢測內(nèi)參時產(chǎn)生“組織特異性”，就是由于抗體選擇不對造成的。 那么應該如何選擇合適的內(nèi)參呢，一般遵循以下原則： 1）樣本種屬來源 首先要考慮的就是實驗樣本來源于什么物種。哺乳動物的組織或者細胞樣本，通常選擇β-actin、Tubulin、GAPDH、Lamin B、PCNA、Na+/K+-ATPase等。植物來源實驗樣本則可以選擇Plant actin、Rubisco等。其他來源樣本研究較少，所以就應該參照文獻報道，選擇合適的蛋白作為內(nèi)參。 2）目的蛋白分子量 選擇內(nèi)參抗體時，應該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KD以上。比如檢測目的蛋白分子量為45KD，此時不適宜選擇β-actin（42KD）作為內(nèi)參，可以考慮選擇GAPDH（36KD）作為內(nèi)參。 3）目的蛋白表達部位 a、胞漿和全細胞蛋白：β-actin（43KD）、GAPDH（37KD）、Tubulin（55KD）等； b、胞核蛋白：PCNA（29KD）、Histone H3（17KD）等； c、核膜蛋白：Lamin B（66KD）等； d、胞膜蛋白：Na+/K+-ATPase（120KD）等； e、線粒體蛋白：COX IV（17KD）、VDAC1（30KD）等。 4）實際的實驗環(huán)境 有些細胞在某些條件下內(nèi)參表達會出現(xiàn)異常，使其不適合做內(nèi)參。比如某些細胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會導致GAPDH的表達增高，不適合做內(nèi)參。在凋亡實驗時，Lamin等也不適合作為內(nèi)參。在加入抗癌和抗真菌藥物時，Tubulin的表達易受影響，不適合作為內(nèi)參。Lamin B不適合作為胚胎干細胞的內(nèi)參，而PCNA不適合作為非增殖細胞的內(nèi)參等。因此設計實驗方案的時候應該考慮這些因素并查詢相應文獻，在實驗過程中也應該注意如果內(nèi)參表達出現(xiàn)異常，應考慮這方面因素。 5）不同的組織特異性 actin 即肌動蛋白，是細胞的一種重要骨架蛋白。actin 大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括beta-actin（β-non-muscle）和gamma-non-muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應該選擇不同的內(nèi)參，不能一概而論。
三、Western Blot中怎樣使用內(nèi)參呢？ 在Western Blot實驗過程中使用的內(nèi)參的方法有：
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