近年來腫瘤代謝相關(guān)研究越發(fā)火熱，高分文章不斷涌現(xiàn)，國自然中標基金數(shù)目也逐年增加。而且其他腫瘤學熱點研究領(lǐng)域中也發(fā)現(xiàn)腫瘤代謝關(guān)鍵酶的異常表達以及相關(guān)代謝產(chǎn)物的異常積累與腫瘤免疫，腫瘤干細胞，腫瘤細胞的表觀遺傳修飾密切相關(guān)。

pubmed中的“Tumor energy metabolism ”的文章發(fā)表量

2018國自然基金中細胞能量代謝的基金數(shù)在50個左右

本系列將以幾個篇幅詳細介紹一下腫瘤代謝的基本概念、研究思路、實驗方法和論文套路。

腫瘤糖代謝

早在1924年Warburg發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞和正常細胞有著不一樣的糖代謝模式。除了有氧狀態(tài)下葡萄糖的攝取速率更高之外，即使在氧濃度正常的條件下，腫瘤細胞仍然傾向于無氧酵解，并能將代謝的乳酸分泌出細胞外，防止底物堆積。顯然，這種有氧糖酵解（aerobic glycolysis）的用氧模式，能讓腫瘤細胞在大量分裂增殖時候游刃有余，毫無壓力。Warburg因此獲得1931年的諾獎。

目前，“Warburg效應”作為腫瘤的一個典型標志已被廣泛認可。2011年，Robert A.Weinberg教授在Cell雜志發(fā)表綜述，將腫瘤異常的代謝表型列入腫瘤十大特征之一。人們幾乎在所有腫瘤中都證實了Warburg效應的存在。同時近年來的研究中也發(fā)現(xiàn)其他諸多代謝通路包括脂肪酸代謝、膽固醇代謝、谷氨酰胺代謝、絲氨酸代謝、一碳單位代謝、膽堿代謝等，在腫瘤細胞中均發(fā)生了重編程變化。但是糖代謝的異常是腫瘤代謝中最為常見和基礎(chǔ)的研究類型。

研究思路

腫瘤代謝研究中的靶點主要著眼于以下兩方面

第一是代謝過程中關(guān)鍵酶，研究其轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄后修飾，最終導致酶表達量的變化以及活性的變化。例如：HIF-1α是Warburg效應的關(guān)鍵調(diào)控因子，通過與糖酵解基因啟動子上的缺氧反應元件（hypoxia-responsive elements, HRE）結(jié)合來促進糖酵解相關(guān)酶的表達。c-Myc能夠直接轉(zhuǎn)錄激活編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運體1 (GLUT1)和乳酸脫氫酶 (LDHA) 的糖酵解基因，并促進異常糖酵解。p53腫瘤抑制因子通過直接抑制GLUT1和GLUT4基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制葡萄搪攝取和乳酸產(chǎn)量。在這些經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄因子外尋找其他的諸如諸如非編碼RNA，表觀遺傳修飾等調(diào)節(jié)是最近研究的趨勢和熱點。

第二是代謝異常導致的中間產(chǎn)物的積累，進而影響表觀遺傳修飾，藥物抗性等其他腫瘤生理過程。如最近的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中甲硫氨酸需求量增加導致其甲基化修飾上調(diào)進而上調(diào)腫瘤干細胞成瘤性。

這兩種研究套路類型我們將在本系列后續(xù)兩篇文章中分別舉例介紹。

研究方法與實驗技術(shù)

腫瘤代謝研究中也需要用到一些特有的實驗方法。如在腫瘤的氧化糖酵解研究中，氧耗率（OCR），和酸化率（ECAR）常被用于衡量氧化磷酸化和糖酵解的強度。其具體實驗步驟如下：

通過加入藥物寡霉素，FCCP，魚藤酮和抗霉素A處理并測定不同時間點的OCR值，反映細胞的氧化磷酸化水平。通過檢測加入葡萄糖，寡霉素，2-DG后的反應，測定不同時間點的產(chǎn)酸率，確定細胞糖酵解速率的變化。

（A）96孔生物能量分析儀細胞培養(yǎng)微型板中單層細胞的鋪備：將配制好的細胞懸液利用血細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，確定細胞密度;取適量體積細胞懸液至1.5 mL EP管中，計算所需細胞數(shù)總量，補充培養(yǎng)基（DMEM + 10％FBS）至800μL;將細胞重新吹勻打散后種于細胞培養(yǎng)板中，每孔80μL，同時在背景校正孔中加入80μL培養(yǎng)基（DMEM + 10％FBS）;將細胞放入37°C，5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

（B）測量探針板的孵化：向探針板的每個孔加入140μLpH7.4的校正液，隨后培養(yǎng)過夜（37度，無CO2）過夜（將探針用保鮮膜包住，以免校正液蒸發(fā)過多）。

（C）在顯微鏡下檢查96孔板中單層細胞的生長情況，確保細胞生長狀態(tài)良好。將96孔板中原有的80μL培養(yǎng)基（DMEM + 10％FBS）吸出，向每孔中加入120μL已溫浴至37°C的培養(yǎng)基，輕輕搖動96孔細胞板，將培養(yǎng)基吸出，再向每孔中加入175μL的分析培養(yǎng)基（上述操作要極為小心謹慎，以免細胞脫離培養(yǎng)板底部）。隨后將96培養(yǎng)板放入到PS裝置中（37°C，無CO2），約1小時。

（D）測量探針板中工作液的加入：將事先配制好的濃度分別為8,9,10,10μmol/ L的寡霉素，F(xiàn)CCP，魚藤酮和抗霉素A工作液，按25μL/孔加入到相對應的A，B，C孔中，使這4種藥物的最終濃度均為1μmol/ L（藥物的最終工作濃度需要根據(jù)細胞的不同而進行優(yōu)化）。

（E）程序的運行：根據(jù)公司提供的說明書設(shè)置程序進行預實驗，若無文獻報道則需進行摸索條件的細胞或藥物可根據(jù)說明書給出的建議進行程序的設(shè)置），運行實驗。導出數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計分析。

對于不同代謝產(chǎn)物在體內(nèi)積累情況則通常會借助PET-CT等技術(shù)手段。其機制是，人體不同組織的代謝狀態(tài)不同，在高代謝的惡性腫瘤組織中葡萄糖代謝旺盛，聚集較多，這些特點能通過圖像反映出來，從而可對病變進行診斷和分析。

而腫瘤代謝研究中的其他功能與機制實驗套路則與常規(guī)腫瘤研究大同小異，具體的研究實例會在接下來幾期文章中為大家介紹。