蓽茇酰胺（Piperlongumine，PLG) 是傳統(tǒng)中草藥蓽茇的一種生物堿單體成分，其具有較好的抗炎、抗氧化作用，且PLG已經(jīng)證實(shí)可以在魚藤酮、6-OHDA、 MPTP等多種 PD 模型中起到神經(jīng)保護(hù)作用。

首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院楊慧教授課題組發(fā)現(xiàn)魚藤酮處理造成線粒體損傷及細(xì)胞凋亡，而 PLG 治療后可以通過激活MAPK8信號(hào)通路，從而促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2 磷酸化，后者一方面通過促進(jìn)其與促凋亡蛋白Bax發(fā)生相互作用抑制細(xì)胞凋亡，另一方面通過與 Beclin1 發(fā)生解離而激活自噬，進(jìn)而清除受損線粒體，間接抑制細(xì)胞凋亡，最終通過調(diào)節(jié)自噬、凋亡再平衡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用（圖1）。

這一重要成果以“Piperlongumine restores the balance of autophagy and apoptosis by increasing BCL2 phosphorylation in rotenone-induced Parkinson disease models”為題發(fā)表于Autophagy（21 Feb 2018；自噬領(lǐng)域TOP期刊，2018年IF = 11.100）。

研究思路與方法

課題組首先發(fā)現(xiàn)，PLG可以緩解魚藤酮誘導(dǎo)的PD動(dòng)物模型中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元缺失以及運(yùn)動(dòng)行為學(xué)障礙，且線粒體可能為 PLG 的干預(yù)靶點(diǎn)（圖2）。

隨后，發(fā)現(xiàn)PLG可以緩解魚藤酮誘導(dǎo)的 Complex I 活力下降， mPTP 的開放，進(jìn)而穩(wěn)定線粒體膜電勢(shì)而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用（圖3）。

上述結(jié)果初步表明PLG通過保護(hù)線粒體功能而緩解魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

第二步，課題組使用魚藤酮和 PLG 處理各組細(xì)胞后，通過 western blots 的方法對(duì)各組細(xì)胞裂解液中自噬標(biāo)志物 LC3-I 向 LC3-II 的轉(zhuǎn)化情況和自噬底物 p62（SQSTM1） 的蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLG 治療組中自噬標(biāo)志物 LC3-II 水平顯著增加， 而自噬底物 p62 水平有所降低，提示 PLG 與魚藤酮共處理的情況下可以激活細(xì)胞內(nèi)自噬水平（圖4）。

此外，課題組通過mRFP-GFP-tagged LC3-expressing virus（吉?jiǎng)P基因構(gòu)建）感染SK-N-SH細(xì)胞和原代神經(jīng)元細(xì)胞以觀察自噬小體生成狀況，并通過 Mito Tracker red 標(biāo)記線粒體， 以觀察了二者的共定位情況。結(jié)果顯示，在魚藤酮與 PLG 共處理組中，出現(xiàn)了明顯的 LC3的綠色熒光點(diǎn)狀聚集體，并且這些綠色熒光聚集體可以與 Mito Tracker 標(biāo)記的紅色線粒體發(fā)生共定位，提示在該處理組中存在線粒體和自噬小體的共定位，即自噬可能參與了線粒體的降解（圖5）。

第三步，課題組接下來使用免疫共沉淀的方法探究 PLG 對(duì)自噬的誘導(dǎo)作用是否是通過影響了Bcl-2-Beclin1 的相互作用情況。結(jié)果顯示，與魚藤酮組細(xì)胞相比， PLG 治療組 Bcl-2-Beclin1 的相互作用水平明顯降低，提示 PLG 處理可能通過促進(jìn)了二者的解離而發(fā)揮了自噬激活作用。而抑制 Bcl-2 可以使 PLG 失去了對(duì) Bcl-2-Beclin1 的解離作用，進(jìn)一步提示了 Bcl-2 可能是 PLG 的作用靶點(diǎn)。此外，在 PLG 與魚藤酮共處理組中， Bcl-2 ser70 位點(diǎn)的磷酸化水平較魚藤酮模型組顯著增加，提示 PLG 處理促進(jìn)了 Bcl-2 ser70 位點(diǎn)發(fā)生磷酸化。以上結(jié)果提示，PLG 可能通過作用于Bcl-2 ser70 位點(diǎn)，促進(jìn)Bcl-2-Beclin1 發(fā)生解離，從而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。

第四步，課題組進(jìn)一步檢測(cè)了Bcl-2-Bax 的相互作用情況，以評(píng)估 PLG 是否可以通過影響 Bcl-2-Bax 異源二聚體的形成而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，與魚藤酮組細(xì)胞相比， PLG 治療組中 Bcl-2-Bax 的相互作用水平增加，后者可以直接抑制細(xì)胞凋亡。綜上提示， PLG 處理可以通過增加 Bcl-2 ser70 位點(diǎn)的磷酸化水平，穩(wěn)定 Bcl-2-Bax 異源二聚體，從而抵抗細(xì)胞凋亡。

第五步，最后，課題組檢測(cè)了 Bcl-2 上游蛋白 MAPK8的激活情況，其激活可以通過磷酸化水平表征。結(jié)果顯示，與魚藤酮組細(xì)胞相比， PLG 治療組 p- MAPK8 水平顯著增加， 且這與 Bcl-2 磷酸化水平增加的結(jié)果相一致，提示 PLG 是通過激活了 MAPK8信號(hào)通路，從而促進(jìn)了 Bcl-2 ser70 位點(diǎn)的磷酸化。此外，以上結(jié)果均在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上也得到了驗(yàn)證，即 PLG 治療后，可以通過激活 MAPK8信號(hào)通路而增加 Bcl-2 ser70 位點(diǎn)的磷酸化水平，后者一方面促進(jìn) Bcl-2-beclin1 發(fā)生解離從而激活自噬，另一方面穩(wěn)定 Bcl-2-Bax 異源二聚體，從而抵抗細(xì)胞凋亡。

研究結(jié)論

PLG可以減輕魚藤酮誘導(dǎo)的PD動(dòng)物模型中的運(yùn)動(dòng)損傷和中腦多巴胺能神經(jīng)元的損失，還改善了由魚藤酮引起的細(xì)胞活力下降，抑制細(xì)胞毒性。這些保護(hù)作用通過激活MAPK8通路增加Bcl2 Ser70位點(diǎn)的磷酸化來抑制細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)自噬。這一發(fā)現(xiàn)表明靶向Bcl2恢復(fù)細(xì)胞凋亡和自噬之間的平衡可能是PD的有效治療方法。