來(lái)源：百邁客醫(yī)學(xué)

眾所周知，液體活檢技術(shù)正在蓬勃發(fā)展中，cfDNA和CTC檢測(cè)都是比較火熱的液體活檢方法，那么二者間孰優(yōu)孰劣呢？下面我們來(lái)看一篇Nature文獻(xiàn)中關(guān)于多發(fā)性骨髓瘤中cfDNA和CTC檢測(cè)的比較研究。

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種起源于漿細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其特征表現(xiàn)為克隆性異常增殖的漿細(xì)胞的骨髓浸潤(rùn)。由癌前階段演變?yōu)橛邪Y狀的MM，由于固有的和獲得性治療抵抗而無(wú)法治愈。提升跟蹤MM中克隆進(jìn)化的方法有助于臨床管理，越來(lái)越多的證據(jù)表明循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTC）和游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）可實(shí)現(xiàn)包括MM在內(nèi)的癌癥微創(chuàng)和基因組特征研究。然而，CTC和cfDNA很少在一起進(jìn)行比較分析，因此CTC和cfDNA是否反映相同的腫瘤克隆以及與傳統(tǒng)腫瘤活檢的相關(guān)性如何尚不清楚。作者推斷超低深度全基因組測(cè)序（ultra-low pass whole-genome sequencing，ULP-WGS）可以提供快速且經(jīng)濟(jì)的篩查和監(jiān)測(cè)工具，以檢測(cè)cfDNA和CTC中的腫瘤分?jǐn)?shù)和拷貝數(shù)改變（CNA），而來(lái)自同一個(gè)MM患者相匹配的CTC、cfDNA和骨髓活檢組織全外顯子組測(cè)序（WES）將有助于解決上述克隆相關(guān)性和液體活檢在MM患者基因組監(jiān)測(cè)中的作用。

使用ichorCNA檢測(cè)SCNA并根據(jù)ULP-WGS數(shù)據(jù)估計(jì)腫瘤分?jǐn)?shù)（tumor fraction），并根據(jù)腫瘤純度為WES選擇樣本。利用上述方法對(duì)疾病進(jìn)展不同階段的107個(gè)cfDNA樣品和56個(gè)CTC樣品進(jìn)行了分析，其中包括意義未明丙種球蛋白血癥(MGUS，n=9 cfDNA樣品 / n=11 CTC樣品)、冒煙型骨髓瘤( SMM，n=28 / n=6)、新診斷的多發(fā)性骨髓瘤MM (n=26 / n=14) 和復(fù)發(fā)性MM（n=44 / n=25）。

作者首先分析了從28位MM患者抽取的相同血液樣本中匹配的cfDNA以及CTC的腫瘤分?jǐn)?shù)。除MM_2205患者外，cfDNA與CTC分析得到腫瘤分?jǐn)?shù)存在很大差異。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)cfDNA與CTC分析得到腫瘤分?jǐn)?shù)之間沒(méi)有相關(guān)性。使用cfDNA或CTC腫瘤分?jǐn)?shù)≥10％（樣本進(jìn)行WES的置信度百分比）時(shí)，可在35％的樣本中檢測(cè)到腫瘤DNA，增加一些未被單獨(dú)的CTC或cfDNA檢測(cè)到的樣本。這表明，分析cfDNA和CTC可能會(huì)擴(kuò)大液體活檢對(duì)MM患者的適用性，前提是cfDNA和CTC產(chǎn)生相似的基因組圖譜。

為了進(jìn)一步證實(shí)患者腫瘤分?jǐn)?shù)的變異性以及與臨床分期的潛在相關(guān)性，作者分析了來(lái)自所有患者的107個(gè)cfDNA樣本和56個(gè)CTC樣本。新診斷和復(fù)發(fā)性MM患者的70個(gè)cfDNA和39個(gè)CTC樣本中，cfDNA樣本中腫瘤分?jǐn)?shù)為≥3％、5％和10％的比例分別為76％、41％和24％。相比之下，100％、62％和31％的CTC樣品分別具有≥3％、5％和10％的腫瘤分?jǐn)?shù)。將MGUS和SMM患者納入cfDNA和CTC樣本組中時(shí)，58％、28％和17％的cfDNA樣本的腫瘤分?jǐn)?shù)≥3％、5％和10％，以及96％、50％和21％的CTC樣本分別具有≥3％、5％和10％的腫瘤分?jǐn)?shù)，表明腫瘤分?jǐn)?shù)隨著疾病進(jìn)展而增加，由于MGUS和SMM處于較早的臨床階段前期，MGUS和SMM患者具有低腫瘤分?jǐn)?shù)。

經(jīng)過(guò)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，cfDNA和CTCs的腫瘤分?jǐn)?shù)與疾病的臨床分期顯著相關(guān)。 cfDNA與修訂的國(guó)際分期系統(tǒng)（R-ISS）和血清游離輕鏈比值（FLC）也有很強(qiáng)的相關(guān)性，而CTC僅與血清游離輕鏈比值相關(guān)，但與R-ISS分期無(wú)關(guān)。總之，這些結(jié)果表明液體活組檢中的腫瘤分?jǐn)?shù)與已知的MM生物標(biāo)志物如血清游離輕鏈比值和R-ISS分期有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。

為了確定cfDNA是否可用于追蹤疾病進(jìn)展或?qū)Ο煼ǖ姆磻?yīng)，作者分析了連續(xù)取樣的cfDNA樣品。MM_0231患者在CD38抗體Daratumumab治療的2個(gè)月隨訪期間顯示疾病進(jìn)展，其腫瘤分?jǐn)?shù)從11％增加到46％，這與血清游離輕鏈比值升高正相關(guān)。MM_2323患者具有相似的變化。

而MM_2205患者對(duì)卡非佐米、雷利度胺和地塞米松具有非常好的部分應(yīng)答，其cfDNA腫瘤分?jǐn)?shù)從22％降低到2％。

MM_2326患者連續(xù)取樣的樣本檢測(cè)結(jié)果是一致的，并且當(dāng)患者中存在穩(wěn)定的疾病負(fù)荷時(shí)相隔數(shù)周后取樣可獲得可重復(fù)性數(shù)據(jù)。

這4個(gè)案例強(qiáng)調(diào)了在將來(lái)的研究中可通過(guò)在治療期間連續(xù)取樣，使用cfDNA作為疾病應(yīng)答/進(jìn)展的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行監(jiān)測(cè)，而骨髓活檢樣本由于取材不易很難實(shí)現(xiàn)監(jiān)測(cè)。

為了研究cfDNA和CTC的基因組圖譜的一致性，作者首先檢測(cè)了ULP-WGS可檢測(cè)的大片段（1 Mb）CNAs，且將重點(diǎn)放在腫瘤分?jǐn)?shù)≥10%的樣本。作者鑒定了MM_2205患者的cfDNA和CTC樣品中13q拷貝數(shù)缺失，MM_2213患者中1p和13q拷貝數(shù)缺失以及1q拷貝數(shù)增加，MM_2214中1p拷貝數(shù)缺失和11q拷貝數(shù)增加。利用ULP-WGS檢測(cè)匹配的cfDNA和CTC中大片段CNV，以及利用WES對(duì)tDNA（骨髓活檢樣本BM）檢測(cè)大片段CNA，檢測(cè)結(jié)果具強(qiáng)相關(guān)性，如下圖MM_2205患者。

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注：紅色為拷貝數(shù)增加，綠色為拷貝數(shù)缺失，藍(lán)色為拷貝數(shù)正常。

接下來(lái)，為下一步評(píng)估cfDNA或CTCs或兩者是否可以反應(yīng)MM的遺傳多樣性，作者對(duì)24個(gè)患者進(jìn)行了WES，其中包含了9個(gè)具有匹配cfDNA和tDNA的病例以及4個(gè)具有匹配的cfDNA、CTC和tDNA的病例，并測(cè)了所有患者的胚系對(duì)照樣本（WBC白細(xì)胞）。不同類型的樣本的目標(biāo)區(qū)域具有相似的覆蓋深度，平均深度為204×。且3種類型的樣本間具有相似的突變特征，克隆和亞克隆SNVs均以CpG位點(diǎn)的C> T轉(zhuǎn)換為主，這種突變過(guò)程被報(bào)道與衰老或APOBEC（載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽）有關(guān)。就克隆異質(zhì)性而言，在同時(shí)具有3種類型樣本的4個(gè)患者中，tDNA中99％的克隆突變被證實(shí)存在于cfDNA或CTC中。相反，在cfDNA或CTC中存在的突變僅94％在tDNA中得到證實(shí)。具有較高腫瘤純度的CTC或cfDNA樣品傾向于揭示更多突變，包含了更大比例的存在于腫瘤活組織檢查中的突變。對(duì)于具有相似cfDNA和CTC腫瘤分?jǐn)?shù)的患者（MM_2205和MM_2017），CTC和cfDNA的測(cè)序結(jié)果仍然發(fā)現(xiàn)了各自獨(dú)有的突變。

注：海軍藍(lán)表示克隆突變，而黃色表示亞克隆突變。每個(gè)樣本下面的左維恩圖，綠色圈為骨髓活檢/tDNA中存在的克隆突變數(shù)目，橙色圈表示在cfDNA或CTC樣品中證實(shí)的tDNA克隆突變數(shù)目；右維恩圖中橙色圈中為存在于cfDNA或CTC樣品中克隆突變數(shù)目，綠色圈為經(jīng)骨髓活檢證實(shí)的克隆突變數(shù)目。

為進(jìn)一步探索cfDNA，CTC和tDNA之間的克隆異質(zhì)性，作者對(duì)匹配的樣本進(jìn)行了聚類分析。大部分突變位于所有病例共享的克隆群中，多數(shù)情況3種類型樣本均可鑒定出亞克隆突變?nèi)海谀承┣闆r下，僅在某一種類型的樣本中可檢測(cè)到亞克隆。表明這些亞克隆突變的等位基因在待檢測(cè)的腫瘤活檢樣品中頻率過(guò)低，或者特定亞克隆不存在于骨髓活檢部位，而僅存在于遠(yuǎn)端骨髓或髓外部位。結(jié)合CTC和cfDNA能夠檢測(cè)到骨髓活檢樣本中發(fā)現(xiàn)的幾乎所有克隆性突變，并檢測(cè)到骨髓中未發(fā)現(xiàn)的其他亞克隆，例如僅在MM_2017患者的cfDNA和CTC中檢測(cè)到TP53亞克隆。cfDNA中存在的非沉默克隆突變平均96％在CTC中被證實(shí)，而CTC中存在的84％非沉默克隆突變?cè)赾fDNA中被證實(shí)。

在9個(gè)匹配的cfDNA和tDNA中觀察到，tDNA中存在的非沉默克隆突變平均有83％在cfDNA中被證實(shí)，而tDNA中88％的非沉默克隆突變被證實(shí)存在于cfDNA中。

MM患者中匹配的cfDNA、CTC和/或tDNA樣本中，鑒定到大多數(shù)MM復(fù)發(fā)性突變基因（例如KRAS、NRAS、BRAF和TP53）以及泛癌癥突變和體細(xì)胞拷貝數(shù)變異SCNAs。

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參考文獻(xiàn)

Manier S, Park J, Capelletti M, et al. Whole-exome sequencing of cell-free DNA and circulating tumor cells in multiple myeloma[J]. Nature communications, 2018, 9.