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［目的要求］ 認(rèn)識(shí)植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的各種污染、材料褐化現(xiàn)象，掌握其防治辦法及應(yīng)急措施 ［知識(shí)模塊］ 異?，F(xiàn)象處理——組織培養(yǎng)污染、褐化問題及其解決辦法 ［教學(xué)重點(diǎn)］ 植物組織培養(yǎng)各類污染的特征與區(qū)分 ［教學(xué)難點(diǎn)］ 應(yīng)急解決辦法 ［教學(xué)方法］ 采用一體化教學(xué)方法，教師借用多媒體進(jìn)行簡(jiǎn)要的講授后帶學(xué)生到培養(yǎng)室與溫室實(shí)地觀察。 第一節(jié) 組培污染及防治 一、污染來源 1. 真菌： 室內(nèi)真菌種類主要有芽枝孢霉屬、曲霉屬、鉸鏈孢霉屬、鐮刀霉屬、青霉屬等，春、夏季，尤其是南方的梅雨時(shí)節(jié)，溫暖潮濕，非常適合真菌生長(zhǎng)。如果長(zhǎng)期使用空調(diào)而不注意通風(fēng)，可引起室內(nèi)真菌污染。室內(nèi)有空調(diào)比沒有空調(diào)情況下曲霉菌落數(shù)多4倍。 2. 細(xì)菌 細(xì)菌是無孔不入的微生物，為避免細(xì)菌的侵襲，科學(xué)家曾嘗試用抗微生物材料生產(chǎn)各種用品，但效果不十分理想，因?yàn)檫@些材料雖然能殺死細(xì)菌，卻充滿了化學(xué)物質(zhì)。 3. 組織培養(yǎng)過程中的污染源 （1）戶外風(fēng)大菌類進(jìn)屋機(jī)會(huì)多 （2）屋內(nèi)太潮菌類繁衍多 （3）物品帶菌多 （4）屋內(nèi)不干凈 （5）屋內(nèi)清理帶菌組培苗 （6）接種不正確 二、傳播途徑 （1）戶外風(fēng)傳播 菌類細(xì)小如塵 隨風(fēng)飄散 由上下落 見濕就長(zhǎng) 有風(fēng)就有沙 有沙就有塵 有塵就有菌 菌塵混共存 （2）渦流傳播 超凈工作臺(tái)上，擺放物品太多，當(dāng)無菌風(fēng)吹過時(shí)，就會(huì)在物品周圍形成渦流群，菌類就會(huì)在渦流群中停留，從而降低凈化效果，增加污染機(jī)會(huì)。 （3）接種傳播 臟手每只帶有細(xì)菌4萬~40萬，干凈的手，指甲蓋大小也有3200多個(gè)細(xì)菌。指甲縫可以窩藏30多種細(xì)菌。如果手上帶菌較多，在操作過程中，就難免有菌落入培養(yǎng)基或植物材料上，而導(dǎo)致污染。另外，不正確操作也會(huì)增加污染機(jī)率掀蓋生硬，滅菌不夠，操作過慢等。接種過程應(yīng)該輕開蓋，火滅慢，操作快。 三、預(yù)防措施 （1）通風(fēng) 經(jīng)常開窗，保持室內(nèi)空氣流通可以使室內(nèi)真菌數(shù)量減少。通風(fēng)方法簡(jiǎn)便易行，應(yīng)多使用。 （2）去濕 保持室內(nèi)空氣干燥，如使用空調(diào)“除濕”功能，也可減少真菌生長(zhǎng)繁殖。 （3）光照 紫外線能殺滅或抑制真菌生長(zhǎng)，對(duì)減少室內(nèi)真菌污染大有好處。 ?。?）防霉 污染物品和污染培養(yǎng)基不要在培養(yǎng)室近距離開瓶洗刷。 四、污染原因判斷及污染苗搶救 （1）若污染菌類是零星分散在培養(yǎng)基中，則可確定是人為引起的污染，比如培養(yǎng)基滅菌不徹底；超凈工作臺(tái)長(zhǎng)時(shí)間不換濾網(wǎng)，致使凈化能力降低；接種用具滅菌不徹底；操作不正確，動(dòng)作生硬緩慢，開瓶時(shí)間太久，接種臺(tái)擺放物品雜亂，操作中心在人體范圍之內(nèi)；接種室長(zhǎng)期不滅菌，菌類太多。 ?。?）若污染菌類是從材料周圍長(zhǎng)起，則可證明是植物材料帶菌引起?？赡苁墙臃N用具滅菌不徹底，接種時(shí)材料被污染；或者是未及時(shí)發(fā)現(xiàn)污染苗，接種過程交叉感染； （3）若是外植體，菌類從材料培養(yǎng)基以上部分長(zhǎng)起，而不是從培養(yǎng)基先長(zhǎng)起，且發(fā)生在5天以后，則說明是材料帶的內(nèi)生菌。若從培養(yǎng)基以下開始長(zhǎng)菌，發(fā)生時(shí)間較早，且有從里向外的趨勢(shì)，則說明是切口引起的污染，原因有是滅完菌后，未剪去兩個(gè)切口或雖剪但器具帶菌； 搶救措施： （1）真菌污染后，如果已形成孢子，則必須經(jīng)高壓滅菌后扔掉，即使僅形成菌絲，菌絲能夠達(dá)到材料內(nèi)部，因此，真菌污染是滅絕性的。但若使細(xì)菌污染，由于細(xì)菌繁殖是靠芽孢，細(xì)菌不會(huì)彌散整個(gè)空間，因此只要及時(shí)發(fā)現(xiàn)，將材料上部未感菌的部分剪下轉(zhuǎn)接，材料仍可以用。 （2）用抗生素等殺菌藥劑的處理，雖有不少報(bào)道，但至今還未發(fā)現(xiàn)那種抗生素能夠?qū)Ω鞣N菌都有效，并且常常也會(huì)影響植物材料的正常生長(zhǎng)分化。另一些藥劑，雖有的殺菌效果好，但往往容易引起鹽害，也無法利用。 第二節(jié) 材料褐化及其防止 一、褐化現(xiàn)象 外植體褐變是指在接種后，其表面開始變褐，有時(shí)甚至?xí)拐麄€(gè)培養(yǎng)基變褐的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會(huì)產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當(dāng)擴(kuò)散到培養(yǎng)基后，就會(huì)抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。 二、褐化的主要原因 （1）品種：研究表明，品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差異，因此有些品種的外植體在接種后較易褐變，而有些花卉品種的外植體在接種后不易褐變。故在培養(yǎng)過程中應(yīng)該有所選擇，對(duì)不同的品種分別進(jìn)行處理。 （2）生理狀態(tài)：外植體的生理狀態(tài)不同，在接種后褐變程度也有所不同。一般來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴(yán)重。 （3）培養(yǎng)基成分：濃度過高的無機(jī)鹽會(huì)使褐化程度增加，此外，細(xì)胞分裂素的水平過高也會(huì)刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐化現(xiàn)象加深。 （4）培養(yǎng)條件不當(dāng)：例如光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。 三、防治措施 （1）選擇合適的外植體：一般來說，最好選擇生長(zhǎng)處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。 （2）合適的培養(yǎng)條件：無機(jī)鹽成分、植物生長(zhǎng)物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。 （3）使用抗氧化劑：在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外使用0．1％～0．5％的活性炭對(duì)防止褐變也有較為明顯的效果。 （4）連續(xù)轉(zhuǎn)移：對(duì)容易褐變的材料可間隔12～24小時(shí)的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7～10天后，褐變現(xiàn)象便會(huì)得到控制或大為減輕。 第三節(jié) 玻璃化問題及其防止 一、玻璃化現(xiàn)象 定義：當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時(shí)，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會(huì)呈半透明狀，呈水跡狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。 危害： ①使試管苗生長(zhǎng)緩慢、繁殖系數(shù)有所下降。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。 ②出現(xiàn)玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，因此使繁殖系數(shù)大為降低。 ③呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物水平較高，細(xì)胞持水力差，植株蒸騰作用強(qiáng)，無法進(jìn)行正常移栽。這種情況主要是由于培養(yǎng)容器中空氣濕度過高，透氣性較差造成的。 在不同的種類、品種間，試管苗的玻璃化程度也有所差異，當(dāng)培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂素水平較高時(shí)，容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì)，能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生。 二、防治措施 （1）增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢(shì)； （2）減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量； （3）增加光照； （4）增加容器通風(fēng)，最好進(jìn)行CO2施肥，這對(duì)減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用； （5）降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生； （6）降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。 第四節(jié) 其他常見問題和解決措施 一、初始培養(yǎng)階段 1、培養(yǎng)物水浸狀、變色、壞死、莖斷面附近干枯 可能原因：表面殺菌劑過量，消毒時(shí)間過長(zhǎng)，外植體選用不當(dāng)（部位或時(shí)期）。 改進(jìn)措施：調(diào)換其他殺菌劑或降低濃度，縮短消毒時(shí)間，試用其他部位，生長(zhǎng)初期取材。 2、培養(yǎng)物長(zhǎng)期培養(yǎng)幾乎無反應(yīng) 可能原因：基本培養(yǎng)基不適宜，生長(zhǎng)素不當(dāng)或用量不足，溫度不適宜。 改進(jìn)措施：更換基本培養(yǎng)基或調(diào)整培養(yǎng)基成分，尤其是調(diào)整鹽離子濃度，增加生長(zhǎng)素用量，試用2，4-D，調(diào)整培養(yǎng)溫度。 3、愈傷組織生長(zhǎng)過旺、疏松，后期水浸狀 可能原因：激素過量，溫度偏高，無機(jī)鹽含量不當(dāng)。 改進(jìn)措施：減少激素用量，適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整無機(jī)鹽（尤其是銨鹽）含量，適當(dāng)提高瓊脂用量增加培養(yǎng)基硬度。 4、愈傷組織太緊密、平滑或突起，粗厚，生長(zhǎng)緩慢 可能原因：細(xì)胞分裂素用量過多，糖濃度過高，生長(zhǎng)素過量。 改進(jìn)措施：減少細(xì)胞分裂素用量，調(diào)整細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比例，降低糖濃度。 5、側(cè)芽不萌發(fā)，皮層過于膨大，皮孔長(zhǎng)出愈傷組織 可能原因：枝條過嫩，生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素用量過多。 改進(jìn)措施：減少激素用量，采用較老化枝條。 二、繼代培養(yǎng)階段 1、苗分化數(shù)量少、速度慢、分枝少、個(gè)別苗生長(zhǎng)細(xì)高 可能原因：細(xì)胞分裂素用量不足，溫度偏高，光照不足。 改進(jìn)措施：增加細(xì)胞分裂素用量，適當(dāng)降低溫度，改善光照，改單芽繼代為團(tuán)塊（叢芽）繼代。 2、苗分化過多，生長(zhǎng)慢，有畸形苗，節(jié)間極短，苗叢密集，微型化 可能原因：細(xì)胞分裂素用量過多，溫度不適宜。 改進(jìn)措施：減少或停用細(xì)胞分裂素一段時(shí)間，調(diào)節(jié)溫度。 3、分化率低，畸形，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)時(shí)苗再次愈傷組織化 可能原因:生長(zhǎng)素用量偏高，溫度偏高。 改進(jìn)措施：減少生長(zhǎng)素用量，適當(dāng)降溫。 4、葉粗厚變脆 可能原因：生長(zhǎng)素用量偏高，或兼有細(xì)胞分裂素用量偏高。 改進(jìn)措施：適當(dāng)減少激素用量，避免葉片接觸培養(yǎng)基。 5、再生苗的葉緣、葉面等處偶有不定芽分化出來 可能原因：細(xì)胞分裂素用量偏高，或表明該種植物適于該種再生方式。 改進(jìn)措施：適當(dāng)減少細(xì)胞分裂素用量，或分階段地利用這一再生方式。 6、叢生苗過于細(xì)弱，不適于生根或移栽 可能原因：細(xì)胞分裂素濃度過高或赤霉素使用不當(dāng)，溫度過高，光照短，光強(qiáng)不足，久不轉(zhuǎn)移，生長(zhǎng)空間窄。 改進(jìn)措施：減少細(xì)胞分裂素用量，免用赤霉素，延長(zhǎng)光照時(shí)間，增強(qiáng)光照，及時(shí)轉(zhuǎn)接，降低接種密度，更換封瓶紙的種類。 7、幼苗淡綠，部分失綠 可能原因：無機(jī)鹽含量不足，PH值不適宜，鐵、錳、鎂等缺少或比例失調(diào)，光照、溫度不適。 改進(jìn)措施：針對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素虧缺情況調(diào)整培養(yǎng)基，調(diào)好PH值，調(diào)控溫度、光照。 8、幼苗生長(zhǎng)無力、發(fā)黃落葉、有黃葉、死苗夾于叢生苗中 可能原因：瓶?jī)?nèi)氣體狀況惡化，PH值變化過大，久不轉(zhuǎn)接導(dǎo)致糖已耗盡，營(yíng)養(yǎng)元素虧缺失調(diào)，溫度不適，激素配比不當(dāng)。 改進(jìn)措施：及時(shí)轉(zhuǎn)接、降低接種密度，調(diào)整激素配比和營(yíng)養(yǎng)元素濃度，改善瓶?jī)?nèi)氣體狀況，控制溫度。 三、生根階段 1、培養(yǎng)物久不生根，基部切口沒有適宜的愈傷組織 可能原因：生長(zhǎng)素種類、用量不適宜；生根部位勇氣不良；生根程序不當(dāng)；PH值不適，無機(jī)鹽濃度及配比不當(dāng)。 改進(jìn)措施：改進(jìn)培養(yǎng)程序，選用適宜的生長(zhǎng)素或增加生長(zhǎng)素用量，適當(dāng)降低無機(jī)鹽濃度，改用濾紙橋液培養(yǎng)生根等。 2、愈傷組織生長(zhǎng)過快、過大，根莖部腫脹或畸形，幾條根并聯(lián)或愈合。 可能原因：生長(zhǎng)素種類不適，用量過高，或伴有細(xì)胞分裂素用量過高，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)程序不對(duì)。 改進(jìn)措施：調(diào)換生長(zhǎng)素種類或幾種生長(zhǎng)素配合使用，降低使用濃度，附加VB2或PG等減少愈傷，改變生根培養(yǎng)程序等。 [ Last edited by bluewondeer on 2010-9-1 at 11:28 ] |
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