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小翊一個正在讀研的師弟最近因為實驗進度的滯后被老板催的厲害，所以在聊天的時候很苦惱：為什么我的qPCR實驗怎么老是做不好？昨天的文庫產(chǎn)量還是那么低……. 其實大多時候?qū)嶒灲Y果不佳的原因往往不在于實驗試劑，也不在于實驗操作，而在于一個簡單卻又易被忽視的問題：核酸樣本質(zhì)控。 核酸質(zhì)控，顧名思義就是對核酸樣本進行質(zhì)量控制。主要是評估核酸的完整性、濃度及純度。 核酸樣本涉及的下游實驗很多，質(zhì)控不合格會影響實驗結果的準確性，甚至得到錯誤的研究結論。 1）DNA樣本質(zhì)控不合格影響文庫產(chǎn)量以及文庫豐度 對于DNA測序來說，樣本質(zhì)控不合格最直觀的呈現(xiàn)就是文庫產(chǎn)量低。而低數(shù)量（濃度）、低質(zhì)量樣本均會影響最終文庫的豐度（圖1）。文庫豐度越高，代表文庫承載的樣本原始信息越多，最終目標區(qū)域會獲得更有效的測序數(shù)據(jù)覆蓋[1]。
圖1 DNA質(zhì)量對于文庫豐度的影響 A. 足夠數(shù)量的高質(zhì)量DNA分子能夠產(chǎn)生高豐度的文庫，很好的呈現(xiàn)起始樣本信息； B. 低數(shù)量、高質(zhì)量的DNA分子產(chǎn)生低豐度的文庫，不能夠完全代表起始樣本； C. 質(zhì)量較差的DNA樣本則會產(chǎn)生低豐度的文庫，因為已經(jīng)損傷的DNA無法被構建文庫； D. 某些情況下，低質(zhì)量的樣本可以通過增加起始投入量來適度彌補文庫豐度[1]。 文庫構建所需樣本量與試劑盒的性能有關，微量高效建庫試劑盒如翊圣Ultima建庫試劑盒起始量低至500 pg亦可高效建庫。即使低質(zhì)量樣本如FFPE，微量樣本如cfDNA均可獲得優(yōu)異的文庫。 2）RNA樣本質(zhì)控不合格影響qPCR定量的準確性 研究表明RNA樣本的RIN值與qPCR實驗的Ct值相關，RIN值越高（代表質(zhì)量越好），則CT值越低[2]（圖2）。 圖2. RNA的RIN值與Ct值的關系。RIN：RNA Integrity Number，原理同DIN值 qPCR實驗建議用于逆轉錄的RNA樣本RIN值>7。此外還可以通過瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA的完整度（一般三條帶）。純度測定A260/A280=1.8-2.0（＜1.8時表明有蛋白質(zhì)或酚污染；＞2.0時表明可能有異硫氰酸殘存），A260/A230>2（＜2表明有異硫氰酸胍，β-巰基乙醇或乙醇的殘留；）。 對于高質(zhì)量的樣本來說，基于紫外吸收法原理檢測的Nanodrop、基于熒光非特異性結合的原理檢測的Qubit以及常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳均可做出全面的質(zhì)控結果。 1）NanoDrop 核酸，包括DNA和RNA，均由核糖、磷酸基以及堿基構成。由于堿基含有芳香環(huán)結構，因此具有紫外吸收的特性。核酸的特征吸收波長為260 nm。根據(jù)朗伯比爾定律可計算核酸濃度。此外根據(jù)A260/A280和A260/A230的數(shù)值可以評估核酸的純度。 常見應用：DNA/RNA濃度測定，純度評估 圖3. NanoDrop全家福 2）Qubit Qubit基于熒光染料非特異性結合dsDNA的雙鏈，在特定的波長光源激發(fā)下，發(fā)出熒光，根據(jù)熒光強度可以對原始的樣本進行定量。因而只要選擇特異性的DNA/RNA染料就能有選擇的定量樣本中的核酸濃度。 常見應用：dsDNA定量如NGS文庫定量等
圖4. Qubit 4.0及其配套試劑 3）核酸電泳 DNA在堿性條件下帶負電荷，在電場中往正極移動，不同DNA由于分子構型不同，在電場中的遷移速率不同，將不同大小的條帶區(qū)分開。 常見應用：DNA/RNA完整性評估，純度評估等。 除了常規(guī)的高質(zhì)量樣本之外，基因應用領域中還存在低質(zhì)量的樣本，如FFPE樣本（石蠟包埋）。針對這類樣本在常規(guī)的濃度純度檢測之外，還需進一步評估。 4）短序列PCR擴增產(chǎn)物的比值 低質(zhì)量樣本隨著時間的延長會慢慢的片段化，因而可以通過對廣泛存在于gDNA的短序列Alu序列（Alu 247與Alu 115）的擴增產(chǎn)物或者不同qPCR擴增產(chǎn)物的濃度比值來衡量DNA的完整性； 注：Alu247/Alu115：Alu序列是廣泛分布于人基因組的約300bp短重復序列。通過長 (247 bp; Alu247) 、短(115 bp; Alu115) 擴增子比值可評估gDNA的完整度。 Q Score：即Quality Score，是指不同qPCR擴增產(chǎn)物濃度的比值。常用的Q129/Q41和Q305/Q41比值分別指129bp和41bp產(chǎn)物、305bp和41bp產(chǎn)物濃度比值。 表1 低質(zhì)量樣本質(zhì)控
5） 樣本DIN值：即 DNA Integrity Number DIN值是指DNA經(jīng)安捷倫生物分析系統(tǒng)分析結合軟件算法計算的數(shù)值。高度完整的 gDNA 樣品在膠圖中以單片段形式遷移，在電泳圖中則顯示為在最大分子量標準峰 (48500 bp) 之上的一個界限清晰的峰。隨著降解程度的增加，一些 gDNA 小片段的肩峰開始形成，且主峰朝著小分子量的方向偏移。高度降解的 gDNA 在膠圖中呈現(xiàn)彌散條帶狀，并在電泳圖中遷移為分子量低于 2000 bp 的寬峰（圖5）。
圖5. 不同樣本降解程度對應的DNA完整值，從右往左DNA降解程度不斷增加，而樣本的DIN值不斷降低。 DIN 通過評估信號在分子量范圍內(nèi)的分布來測定基因組 DNA 的降解程度，將每個樣品信號與其他所有信號進行對比，從而生成 DIN值。 IDT曾使用了DIN值和Q129/Q41來對不同FFPE樣本DNA進行質(zhì)量檢測，結果顯示DIN值和Q129/Q41具有很好的相關性(圖6) 圖6. 不同質(zhì)控參數(shù)對FFPE樣本(Blocks 1–5)的DNA質(zhì)量評估顯示DIN值和Q129/Q41具有很好的相關性。
參考文獻： [2]. Fleige S, Walf V, Huch S, et al. Comparison of relative mRNA quantification models and the impact of RNA integrity in quantitative real-time RT-PCR.[J]. Biotechnology Letters, 2006, 28(19):1601-1613. |
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