薄層色譜法簡稱TLC，是在50年代從經(jīng)典柱色譜法和紙色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種色譜技術(shù)。60年代后，人們對薄層色譜法的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化及擴(kuò)大應(yīng)用等方面進(jìn)行了許多工作，使該方法日趨成熟?，F(xiàn)已成為現(xiàn)代有機(jī)合成、高分子材料分離與解析的重要方法。結(jié)合柱分離的薄層色譜技術(shù)能夠具有充分的實(shí)戰(zhàn)意義。

薄層色譜是一種微量分析的分離過程，它將樣品點(diǎn)在以玻璃板或鋁、塑料等片材為載體的多孔吸附劑薄層的固定相上，利用流動相在特定的展開室中將混合物中的組份推移到不同距離處，在色譜展開整個(gè)過程中，樣品的成份受到正反不同的力的作用。

1、 流動相利用毛細(xì)管力帶著樣品穿過固定相；

2、樣品與固定相的相互作用是指組份在移行過程中由于偶極 -（誘導(dǎo)） - 偶極相互作用，氫鍵和范德華力的作用而產(chǎn)生不同程度的延緩、吸附、分散、離子交換和絡(luò)合等分離機(jī)理。

用顯色試劑處理，許多組份可在日光或紫外燈光下檢視。色譜可用肉眼或使用光密度計(jì)和照相機(jī)記錄或影像系統(tǒng)方法來評價(jià)。

1、手工自制板

1）、玻璃板的要求：用于制備薄層板的玻璃板要求表面光潔、平整，最好使用厚薄1~2mm的優(yōu)質(zhì)平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制作薄層板，玻璃板需洗凈至不掛水，晾干，貯存于干燥潔凈處備用。玻璃板反復(fù)使用時(shí)，應(yīng)注意經(jīng)常用洗液及堿液清洗，保持玻璃板面的光潔是保證薄層板質(zhì)量的最基本要求。

2）、制作方法：除另有規(guī)定外，將1份吸附劑加適量的水（如1份硅膠G一般加3份水），在研缽中用研杵沿一個(gè)方向小心研磨至成均勻的有適當(dāng)粘稠度的膠漿,立即傾入涂布器中,均勻地向前推進(jìn)涂布在玻璃板上;或按照不同涂布器的規(guī)定操作涂布;涂布好的薄層板于室溫下在水平臺上晾干,再在規(guī)定的溫度(一般為105℃~110℃)下烘約30分鐘活化,貯于干燥器中備用。薄層板的厚度一般為0.25~0.5mm.。

2、商品化供應(yīng)的預(yù)制板和高效板

1）、板的尺寸   

圖1  不同的板尺寸

TLC/HPTLC預(yù)制板有不同的規(guī)格供應(yīng)。常用的尺寸為20 x 20，10 x 20，20 x 10，或10x 10 cm。使用的規(guī)格取決于TLC或HPTLC的類別和樣品的數(shù)目。

3、 TLC/HPTLC板的預(yù)洗及活化

一般來說，色譜板應(yīng)用溶劑如氯仿-甲醇(8:2)，甚至用更強(qiáng)的洗脫溶劑的混合物進(jìn)行預(yù)洗。具體操作可通過空白色譜展開來實(shí)現(xiàn)。色譜板預(yù)洗完后,應(yīng)在105?C加熱1小時(shí)進(jìn)行干燥，再在室溫下置放至少2小時(shí)（需采取保護(hù)措施以防止實(shí)驗(yàn)室空氣中的污染物重新附著在其上面，如放置在空的干燥器中）。

薄層色譜操作

1、點(diǎn)樣：除另有規(guī)定外，用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣于薄層板上，一般為圓點(diǎn)，點(diǎn)樣基線距底邊2.0cm，點(diǎn)樣直徑為2-4mm，點(diǎn)間距離約為1.5-2.0cm，點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以不影響檢出為宜。點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面。

樣品點(diǎn)樣位置。起點(diǎn)的最佳位置如圖2和3所示。起點(diǎn)下緣的最小距離b取決于溶劑量。兩個(gè)起點(diǎn)之間的距離c必須令平行移行的主成份不會相互觸及。點(diǎn)狀點(diǎn)樣時(shí)原點(diǎn)的直徑應(yīng)小于或等于3mm（高效板原點(diǎn)的直徑應(yīng)更?。?條帶的長度d由點(diǎn)樣樣品體積或樣品的種類和相對于板的尺寸點(diǎn)樣的數(shù)目來決定。到板側(cè)邊的距離a必須足夠大以避免分離區(qū)失真變形（見圖2和3）。

圖2： 斑狀樣品點(diǎn)樣的一般點(diǎn)樣位置（a = 20mm, b = 10mm, c =兩起點(diǎn)之間的距離。）

圖3：  條狀樣品點(diǎn)樣的一般點(diǎn)樣位置（a = 20mm, b = 10mm, c = 兩起點(diǎn)之間的距離，d = 條的長度）

2、 展開：展開室如需預(yù)先用展開劑飽和，可在室中加入足夠量的展開劑，并在壁上貼二條與室一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開劑中，密封室頂?shù)纳w，使系統(tǒng)平衡或按正文規(guī)定操作。

方法A：  用放入濾紙使飽和（至少30分鐘）；在兩個(gè)槽內(nèi)盛放溶劑；每個(gè)展開室只有一塊TLC/HPTLC板

方法B：不呈飽和狀態(tài)；無濾紙；只有一個(gè)槽內(nèi)有溶劑；每個(gè)展開室只有一塊TLC/HPTLC板

將點(diǎn)好樣品的薄層板放入展開室的展開劑中，浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.5—1.0cm（切勿將樣點(diǎn)浸入展開劑中），密封室蓋，等展開至規(guī)定距離（一般為10—15cm），取出薄層板，晾干，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定檢測，如需用薄層掃描儀對色譜斑點(diǎn)作掃描檢出，或直接在薄層上對色譜斑點(diǎn)作掃描定量，則可用薄層掃描法。薄層掃描的方法，除另有規(guī)定外，可根據(jù)各種薄層掃描儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及使用說明，結(jié)合具體情況，選擇吸收法或熒光法，用雙波長或單波長掃描。由于影響薄層掃描結(jié)果的因素很多，故應(yīng)在保證供試品的斑點(diǎn)在一定濃度范圍內(nèi)呈線性的情況下，將供試品與對照品在同一塊薄層上展開后掃描，進(jìn)行比較并計(jì)算定量，以減少誤差。各種供試品，只有得到分離度和重現(xiàn)性好的薄層色譜，才能獲得滿意的結(jié)果。

3、顯色

若層析板分離的物質(zhì)肉眼看不見又不能被紫外光活化，需加顯色試劑浸漬或均勻噴灑于薄層板面上，直接觀察或加熱顯色后觀察。加熱顯色者須注意加熱時(shí)間和溫度，尤其含羧甲基纖維素鈉的薄層板，加熱溫度過高或時(shí)間過長，容易引起板面的焦化，如用硫酸等顯色劑更易造成板面的炭化而影響顯色效果。有的成分加試劑后，如揮發(fā)油成分經(jīng)香草醛硫酸顯色，加熱溫度和時(shí)間長短不同或放置時(shí)間不同均可能使斑點(diǎn)的顯色有所改變。有的品種可熏以試劑或試液的蒸氣（如碘蒸氣、氨蒸氣）顯色。

薄層層析操作關(guān)鍵點(diǎn)

1、鋪板

鋪板用的勻漿不宜過稠或過?。哼^稠，板容易出現(xiàn)拖動或停頓造成的層紋；過稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G:水=1：2～3，硅膠G:羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時(shí)間，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過拿起研棒時(shí)勻漿下滴的情況來判斷，越稠越難下滴。勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進(jìn)一步影響上樣量。涂層薄，點(diǎn)樣易過載；涂層厚，顯色不那么明顯。通常，板的質(zhì)量對薄層鑒別的影響不是很大，影響最大的是展開劑的配制和展開系統(tǒng)的飽和。

2、點(diǎn)樣

盡量用小的點(diǎn)樣管。如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點(diǎn)樣管。這樣，點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開的色譜圖分離度好，顏色分明。樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，點(diǎn)樣斑點(diǎn)擴(kuò)散大。樣品溶液的溶劑一般是無水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。點(diǎn)好樣的薄層板用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹干或放入干燥器里晾干。

3、展開劑配制

選擇合適的量器把各組成溶劑移入分液漏斗，強(qiáng)烈振搖使混合液充分混勻，放置，如果分層，取用體積大的一層作為展開劑。絕對不應(yīng)該把各組成溶液倒入展開缸，振搖展開缸來配制展開劑?；旌喜痪鶆蚝蜎]有分液的展開劑，會造成層析的完全失敗。各組成溶劑的比例準(zhǔn)確度對不同的分析任務(wù)有不同的要求，盡量達(dá)到實(shí)驗(yàn)室儀器的最高精確度，比如：取1ml的溶劑，應(yīng)使用1ml的單標(biāo)移液管，移液管應(yīng)符合計(jì)量認(rèn)證要求，盡管多數(shù)時(shí)候這不是必須的。

5、展開系統(tǒng)的飽和

一般使用的是雙槽的展開缸，一槽用來放展開劑，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展開的板放入兩槽間的平臺，斜架著，蓋上展開缸的蓋子。讓展開劑的蒸氣充滿展開缸，并使薄層板吸附蒸氣達(dá)到飽和，防止邊沿效應(yīng)，飽和時(shí)間在半個(gè)小時(shí)左右。展開時(shí)難免要打開蓋子把薄層板放入展開劑中，不過對薄層板與蒸氣的吸附平衡影響不大，當(dāng)然動作應(yīng)該盡量輕、快。 

6、溫濕度的控制

溫濕度對薄層影響都很大。不凍結(jié)的前提下，通常溫度越低分離越好，較難的分離需在低溫下分離，例如人參皂苷。濕度的影響，估計(jì)主要是影響薄層板的吸附能力，導(dǎo)致選擇性（容量因子）的變化，濕度應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況確定。溫度控制使用空調(diào)器或冰柜，濕度控制是通過在另一展開槽放置相應(yīng)濃度的硫酸。

7、顯色

噴顯色劑顯色最重要是有好的霧化器。

TLC點(diǎn)板標(biāo)準(zhǔn)操作條件

以20 x 20和10 x 20 cm TLC預(yù)涂板的標(biāo)準(zhǔn)條件為例，以便于參考。

1、怎樣提高點(diǎn)樣效率？

點(diǎn)樣是造成TLC定量誤差的主要來源。實(shí)驗(yàn)證明：定量毛細(xì)管更適合較小體積的點(diǎn)樣；微量注射器更適合較大體積的點(diǎn)樣。這主要是因?yàn)槲⒘孔⑸淦魇苄馀?、溶液回爬現(xiàn)象的影響較大。為避免不同定量毛細(xì)管理體制的占樣誤差，建議一塊薄層板上最好用同一只定量毛細(xì)管。

在制備樣品時(shí)，溶樣溶劑黏度不能過高，以便于點(diǎn)樣；溶劑沸點(diǎn)過低則進(jìn)樣體積易變，過高則會改變展開劑組成；對樣品溶解度過高會使樣點(diǎn)發(fā)生空心現(xiàn)象，常用的溶劑為甲醇、乙醇、丙酮。經(jīng)典TLC樣點(diǎn)原點(diǎn)一般為直徑3mm點(diǎn)間距離1-2cm底邊距離1.5cm；HPLC樣點(diǎn)原點(diǎn)一般為直徑1mm點(diǎn)間距5mm底邊距1cm。

2、展開劑的選擇

TLC與HPLC相比，一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)就是流動相的選擇具有更大的靈活性，流動相的選擇的目的是使絕大部分樣品的Rf值位于0.1－0.7之間并達(dá)到較好的分離，與此對應(yīng)的是流動相要有適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度和組成。流動相強(qiáng)度越大，溶質(zhì)Rf值越大，但很可能降低分離能力；另外單一溶劑很難分離較復(fù)雜的混合物、根據(jù)相似相溶原理，要使用多元溶劑體系。

一般展開劑體系選擇如下：根據(jù)分離樣品性質(zhì)、薄層色譜板性質(zhì)選擇一個(gè)二元溶劑體系，通過調(diào)節(jié)溶劑比例以尋求適合Rf值，適合的Rf值找到后，再尋求極性參數(shù)相同的二元溶劑體系兩個(gè)，以這三個(gè)組成為三點(diǎn)組成一個(gè)三角形，則可看到：三角形頂點(diǎn)是二元體系，邊是三元體系，三角形內(nèi)是四元體系，并且極性一致，可根據(jù)幾何原理得出任一點(diǎn)組成，這種方法較為直觀，也較簡單。

3、TLC的通用顯色方法

理想的顯色希望靈敏度高，斑點(diǎn)顏色穩(wěn)定、斑點(diǎn)與背景間的對比度好，斑點(diǎn)的大小及顏色的深度與物質(zhì)的量成正比，在樣品組成并不完全已知的情況下，通用顯色方法顯得尤為重要，通用顯色方法主要有：

1）、紫外照射法：方便、不破壞樣品；

2）、碘蒸氣法：通用性強(qiáng)，與紫外法結(jié)合靈敏度高于該兩法單獨(dú)使用；

3）、熒光試劑：制造熒光背景，使原來紫外下無熒光物質(zhì)被鑒別，有熒光物質(zhì)更明顯；

4）、硫酸溶劑：對絕大多數(shù)有機(jī)物有效，但有破壞性。

1、定性鑒別

化學(xué)上經(jīng)典的定性鑒別，例如經(jīng)典的有機(jī)定性分析或經(jīng)典的毒物分析，是利用各種化合物的溶解度不同和所含功能基的不同，用溶劑提取或用試劑處理，把它們分組或分為單一組分，然后作試管反應(yīng)或點(diǎn)滴反應(yīng)（顏色反應(yīng)），或根據(jù)它們衍生物的理化性質(zhì)進(jìn)行定性鑒別。這種方法的缺點(diǎn)是樣品用量較大，分離手續(xù)麻煩，分析時(shí)間較長（幾小時(shí)或幾十個(gè)小時(shí)），并可能有雜質(zhì)干擾，現(xiàn)采用合適的展開劑和顯色劑在薄層上作為分離和鑒別，根據(jù)樣品中組分的值和顯色情況，同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)作對照，一般即能確證為某一化合物，用薄層色譜法定性，樣品用量小，分離方便，分離時(shí)間短（幾分鐘或幾十分鐘），檢出靈敏度高。例如，在毒物分析中檢驗(yàn)是否巴比妥安眠藥中毒時(shí)，取胃內(nèi)容物或尿樣品，先用鹽酸酸化后，用乙醚提取，乙醚提取液脫水，過濾蒸干，溶于無水乙醇中，點(diǎn)在硅膠版上用氯仿無水乙醇（36：1）展開，用硫酸汞二苯偶碳酰肼試劑顯色，并用標(biāo)準(zhǔn)品對照，依次見出巴比妥，苯巴比妥，戊巴比妥和異巴比妥。鑒別速度快（1小時(shí)），這對于搶救中毒患者和及時(shí)為醫(yī)生提供治療方案極為重要。

2、化合物質(zhì)量控制與雜志檢查

藥品的純度，通常用熔點(diǎn)，吸光值等物理常數(shù)作為鑒定的指標(biāo)。但是薄層檢查也是藥品質(zhì)量控制和雜質(zhì)檢查的一種有效方法，有時(shí)甚至比一般方法更有效。一些國家的藥典和藥品規(guī)范已經(jīng)采用。方法是把一定量的樣品溶液（例如，相當(dāng)于樣品10%）點(diǎn)在薄層上，用展開劑展開并顯色，同時(shí)用純品作對照，如果樣品不只顯示出純品位置一致的一個(gè)斑點(diǎn)，則表示含有雜質(zhì)。進(jìn)一步可用薄層作雜質(zhì)的限量檢查。在上例中，如果已經(jīng)知道顯色劑對雜質(zhì)的最小檢出量為0.1%，在薄層上點(diǎn)樣后不顯出雜質(zhì)斑點(diǎn)，則雜質(zhì)的量低于0.1%，或低于限度，也就是樣品的純度不低于99.9%。例如鎦體藥物的合成和精致工作中，常含結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)，即按上述方法控制其質(zhì)量和雜質(zhì)的限量。

3、化學(xué)反應(yīng)進(jìn)程的控制

反應(yīng)副產(chǎn)物的檢出以及中間體的分析，在化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間或反應(yīng)終了時(shí)，把反應(yīng)液取出作薄層分析，可以知道還剩下多少原料藥未起作用。方法是把反應(yīng)液或其有機(jī)溶劑提取液點(diǎn)在薄層上，同時(shí)點(diǎn)原料作參比對照，看薄層上是否出現(xiàn)原料藥斑點(diǎn)。還可以用薄層檢查反應(yīng)副產(chǎn)物。如果化學(xué)反應(yīng)分步進(jìn)行，則每一步反應(yīng)的中間體的質(zhì)量和產(chǎn)率也都可用薄層進(jìn)行定性和定量。例如在合成強(qiáng)力霉素的過程中，需要中間體甲烯土霉素氫化物為脫氧土霉素。氫化反應(yīng)是否完全，可用薄層檢查，如果反應(yīng)完全，則反應(yīng)釜中幾乎沒有或只有極少量的甲烯土霉素存在，薄層板上只顯示出一個(gè)脫氧土霉素，如果薄層板上有上下二個(gè)明顯的斑點(diǎn)，表示反應(yīng)還沒有完全，尚需繼續(xù)還原，直到只顯示出脫氧土霉素的一個(gè)斑點(diǎn)為止才能出料。

4、柱色譜法分離條件的探索

柱色譜法的實(shí)驗(yàn)條件，例如選用什么吸附劑和洗脫劑較好，各個(gè)組分按什么順序從柱中洗脫出來，每一分洗脫液中是含單一組分或就含幾種沒有分開的組分等，都可以在薄層上進(jìn)行探索和檢驗(yàn)。薄層上所有的展開劑雖不完全照搬柱色譜法上，但仍有參考價(jià)值。

綜自：網(wǎng)絡(luò)，二知了。