隨著手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療、靶向治療及免疫治療等多種治療方式的綜合應(yīng)用，癌癥病人的生存期明顯延長，如何進(jìn)一步提高癌癥病人的生存質(zhì)量仍面臨著巨大挑戰(zhàn)。

循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）作為一種潛在的腫瘤標(biāo)記物，其檢測低創(chuàng)傷性、可重復(fù)性，能為癌癥病人的早期診斷、腫瘤負(fù)荷監(jiān)測、藥物療效預(yù)測、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后評估提供有效信息。

循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）概述

1948年，Mandel和Métais首次在人類血漿中檢測出細(xì)胞外循環(huán)游離DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）。腫瘤病人體內(nèi)存在的cfDNA，是由腫瘤細(xì)胞、炎性細(xì)胞等異常或正常細(xì)胞釋放到血管中的游離DNA片段組成的。

cfDNA中，攜帶腫瘤特有突變的小部分DNA片段稱為循環(huán)腫瘤DNA，其來源于腫瘤細(xì)胞并通過凋亡、壞死或直接分泌的方式釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。ctDNA的清除可能與肝臟和腎臟代謝有關(guān)，由于DNA片段大小、結(jié)構(gòu)等不同，其半衰期從數(shù)分鐘到數(shù)小時不等。

循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）的檢測方法

ctDNA檢測也稱作“液態(tài)活檢”，其能全面的反映與腫瘤組織相同的突變基因組信息，包括點突變、基因擴(kuò)增、拷貝數(shù)異常、過度甲基化等。其中TP53（tumor protein p53）、PIK3CA（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase，catalytic subunit alpha）和GATA3（GATA binding protein 3）三種基因突變的檢出率較高。

目前，ctDNA的檢測方法主要有數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（dPCR）和二代測序（NGS）。

（一）數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

dPCR是一種核酸分子絕對定量檢測技術(shù)，即將含有核酸模板的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系，平均分配成上萬個和數(shù)百萬個PCR反應(yīng)，分配到芯片或微滴中，使每個反應(yīng)中盡可能含有一個模板分子，進(jìn)行單分子模板PCR反應(yīng)，通過讀取熒光信號的有或無進(jìn)行計數(shù)，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)泊松分布的校準(zhǔn)進(jìn)行絕對定量。

但是，dPCR只能分析評估單一的數(shù)量有限的堿基對改變，通量相對較低，僅用于對已知的特定基因進(jìn)行定量檢測。在dPCR的基礎(chǔ)上，microfluidic PCR、ddPCR及BEAMing（bead emulsion amplification magnetic）等技術(shù)的進(jìn)步提高了ctDNA檢測的靈敏度。

（二）二代測序

NGS技術(shù)的發(fā)展實現(xiàn)了對全部基因或某些指定區(qū)域進(jìn)行測序，提高了測序速度，降低了測序成本，并能發(fā)現(xiàn)未知突變序列，從而獲取更多腫瘤遺傳信息。目前，安全測序系統(tǒng)（safe-sequencing system，Safe-SeqS）和雙向測序（duplex sequencing）可提高NGS檢測ctDNA的靈敏度及特異度。

安全測序系統(tǒng)為目標(biāo)基因增加一個稱為UID（unique identifier）的特定編碼的序列，然后進(jìn)行擴(kuò)增，增加目標(biāo)基因的濃度，即可有效提高后續(xù)測序的靈敏度。雙向測序類似于安全測序系統(tǒng)，不同在于最終擴(kuò)增的是目標(biāo)基因的雙鏈并同時測序，以顯示目標(biāo)基因的真實突變。有研究表明，在cfDNA足量時，NGS的靈敏度（0.02%~5.00%）取決于測序深度。測序深度越高，相對應(yīng)的靈敏度及特異度越高，得到的數(shù)據(jù)信息量也越大，同時時間及成本也會增加，應(yīng)根據(jù)研究及應(yīng)用需要合理選擇。

擴(kuò)增子測序?qū)儆贜GS技術(shù)，其原理是邊合成邊測序。用不同顏色的熒光標(biāo)記4種脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleotide triphosphate，dNTP），當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出不同熒光，根據(jù)計算機(jī)軟件來處理捕捉到的熒光信號，可以獲得待測的DNA序列信息。針對多種DNA，通過多重PCR技術(shù)，把ctDNA攜帶的特殊基因突變區(qū)段擴(kuò)增出來，進(jìn)行高通量測序和分析。

腫瘤個性化分析深度測序（CAPP-Seq）是新的NGS技術(shù)，CAPP-Seq基于捕獲技術(shù)的進(jìn)步，可以用于特定腫瘤類型的大部分病人，并可以探測幾乎所有主要類型的突變。在測序前通過雜交靶向基因成反義寡核苷酸來豐富基因組，從而增加了檢測的敏感度，能有效分析不同病人的ctDNA。

目前，ctDNA檢測方法及結(jié)果處理缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，仍不能廣泛應(yīng)用于臨床，但二代測序檢測相關(guān)指南的出臺即將改觀此現(xiàn)象。