2.  總論

2.1  術語

突變是指核苷酸序列的永久性改變, 而多態(tài)性是指頻率超過1%的變異。雖然術語“突變”和“多態(tài)性”已被廣泛使用, 但由于這兩個術語已經(jīng)錯誤地與致病性和良性結果關聯(lián)了起來, 所以往往會造成混淆。因此, 建議使用“變異”加以下修飾詞替代上述兩 個術語: 致病性的、可能致病性的、意義不明確的、可能良性的或良性的。雖然這些修飾詞不可能適用所有的人類表型, 但是正如本指南提出的它包含了孟德爾疾病相關的變異分類五級系統(tǒng)。建議所有致病性(包括可能致病)的結論需要注明疾病及相應的 遺傳模式(如c.1521_1523delCTT(p.Phe508del), 致病性,  囊性纖維化, 常染色體隱性遺傳)。

應當注意的是, 一些實驗室可能選擇其他等級 (如意義不明確的變異的子分類 , 特別是內(nèi)部使用時), 這種做法不被認為與指南不一致. 還應當指出的是, 某種程度上本指南推薦的術語與細胞遺傳學基因芯片檢測的拷貝數(shù)變異分類不同。雖然拷貝數(shù)變異分類系統(tǒng)也包括五級分類標準, 但是它使用“臨床意義不明確-可能致病的”和“臨床意義不明確-可能良性的”。由于本指南提出的“可能的”變異分類標準比拷貝數(shù)變異分類指南中用到的“可能的”包含更強的證據(jù), 合并這兩個“可能的”分類會使醫(yī)務工作者和臨床報告接收者產(chǎn)生混淆, 因此大多數(shù)工作組成員不支持使用“意義不明確的”來修飾“可能致病的” 或“可能良性的”. 然而, 有人認為“可能的”一詞的使 用應限于有數(shù)據(jù)支持其致病性或良性可能性很大的變異。雖然對“可能的”一詞沒有量化的定義, 但是在某些變異分類系統(tǒng)中已有指導性意見。然而, ACMG 開放論壇的一項調(diào)查建議“可能的”這一術語具有更廣泛的適用性。認識到這一點, 建議術語“可能致病的”和“可能良性的”用來說明一個具有大于 90%可能引起致病或者可能良性的變異, 盡管是人為的界定, 但還是給實驗室提供了一種共同的定義。類似地, 國際癌癥機構指南支持致病性的確定水平為 95%, 但是工作組(通過 ACMG 公開論壇期間的反饋確認)認為,  臨床醫(yī)生和患者愿意容忍略高的錯誤機會,  從而做出確定為 90%的決定。還應當指出的是, 考慮到多數(shù)疾病具有異質(zhì)性, 目前大多數(shù)變異沒有數(shù)據(jù)能將它們量化性地歸于上述五個變異類別之一。希望隨著時間的推移, 能夠建立實驗和統(tǒng)計方法來客觀地賦予變異的致病可信度, 并且采用更嚴格的方法來定義臨床專業(yè)人員所期望達到的可信度, 從而能更完整地詮釋這些術語及可能性。

新術語的使用可能需要專業(yè)培訓, 鼓勵專業(yè)團隊對所有實驗室和醫(yī)務工作者進行這些術語的培訓,也鼓勵實驗室直接對其開具檢測報告單的醫(yī)生進行培訓教育。

2.2  命名

建議通過一套規(guī)范的標準對變異進行統(tǒng)一命名來確保變異的明確定義, 并實現(xiàn)基因組信息的有效共享和下游使用. 標準的基因變異命名由人類基因組變異協(xié)會 (the Human Genome Variation Society, HGVS) 維護和版本化 (https://www./mutnom en), 除非另有說明, 一般推薦該命名法作為確定變異命名的首要準則。實驗室應該注意他們在實驗方法中所使用的版本。當描述變異時，可利用這些工具提供正確的 HGVS 命名(http://)。臨床報告應該包含參考序列以確保該變異在 DNA 水平上的明確命名, 并提供編碼和蛋白質(zhì)命名法來協(xié)助功能注釋(如“g”為基因組序列, “c”為編碼 DNA 序列, “p” 為蛋白質(zhì), “m”為線粒體)。

編碼命名應該使用翻譯起始密碼子 ATG 中的 “A”作為位置編號1來描述. 在傳統(tǒng)命名已被使用的地方, 當今命名應該對傳統(tǒng)命名進行額外注釋。參考序列應該是完整的, 并來源于具有版本號的美國生物技術信息參考序列數(shù)據(jù)庫 (http://www.ncbi. nlm./Refseq/)或LRG 數(shù)據(jù)庫(http://www.lrg-se quence.org)?；蚪M坐標應根據(jù)標準基因組版本(如 hg19)或覆蓋整個基因(包括 5'和 3'非翻譯區(qū)以及啟動子)的基因組參考序列來界定。當描述編碼變異時, 應該在報告中使用和提供每個基因的一個參考轉錄本。該轉錄本應該是最長的已知轉錄本或者是最具臨床相關性的轉錄本。協(xié)會支持的參考轉錄本通?？梢酝ㄟ^ LRG 數(shù)據(jù)庫(http://www.)、 CDS 共識數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm./CCDS/ CcdsBrowse.cgi) 、人類 基因突變數(shù)據(jù)庫(http:// www.hgmd.cf.ac.uk) 、 ClinVar(http://www.ncbi.nlm./clinvar)或特異基因座數(shù)據(jù)庫來確定。然而 , 當這些區(qū)域發(fā)生臨床可解釋的已知變異時, 實驗室應該評估該變異對所有臨床相關的轉錄本的影響 , 包括含有其他外顯子或非翻譯區(qū)延伸的可變剪切轉錄本。

HGVS(https://www./mutnomen) 并未覆蓋所有類型的變異(如復雜變異), 但是復雜變異的可能描述已被報道。 此外, ACMG 支持 HGVS 命名規(guī)則之外的三種特殊例外: (i) 除了當今 HGVS 推薦的“*”和“Ter”, “X”仍然被認為用于報告無義變異; (ii) 建議根據(jù)指定變異選擇的參考轉錄本對外顯子進行編號; (iii) 通常因為臨床解釋直接評估致病性, 所以推薦使用術語“致病性”而不是“影響功能”。

2.3  文獻及數(shù)據(jù)庫使用

目前人類基因組中大量變異不斷被發(fā)現(xiàn), 且已被許多數(shù)據(jù)庫廣泛收錄。當臨床實驗室需要對某一變異進行分類并出具報告時, 可在已有的數(shù)據(jù)庫及發(fā)表的文獻中尋找到有價值的參考信息。如上文提及, 序列數(shù)據(jù)庫還可用于確定合適的參考序列。數(shù)據(jù)庫有助于信息收集,  但需謹慎使用。

人群數(shù)據(jù)庫(表1)適用于獲取某變異在大規(guī)模人群中發(fā)生頻率的相關信息。 需要注意的是, 人群數(shù)據(jù)庫中的信息不僅來源于健康個體, 也包含致病性的變異。另外, 人群數(shù)據(jù)庫并不包含變異的功能效應及可能關聯(lián)的表型等相關信息。在使用人群數(shù)據(jù)庫時, 須明確數(shù)據(jù)庫收錄的是健康群體的信息還是患病群體的信息; (如能確認)數(shù)據(jù)庫是否收錄了同一家庭多名成員的信息以及數(shù)據(jù)庫收錄的受試者的年齡范圍。

疾病數(shù)據(jù)庫(表1)主要包含病患中發(fā)現(xiàn)的變異以及對其致病性的評估。疾病數(shù)據(jù)庫和特定基因的數(shù)據(jù)庫常包含一些分類錯誤的變異,  這些變異在已發(fā)表的同行評審的文獻中被錯誤判定, 而多數(shù)數(shù)據(jù)庫在收錄變異相關信息時并未對證據(jù)進行基本的審核。因此, 在使用疾病數(shù)據(jù)庫時, 考慮患者是如何被確診的尤為重要,  如下所述:

當使用數(shù)據(jù)庫時,  臨床實驗室應做到:  (i)  確定數(shù)據(jù)庫的更新頻率, 確定數(shù)據(jù)庫收錄相關數(shù)據(jù)時是否進行了校勘,  以及采用什么方法進行數(shù)據(jù)校勘; (ii)確認采用 HGVS 命名體系, 并確定描述變異的基因組版本和轉錄本參考序列; (iii)  確定數(shù)據(jù)分析準確度的驗證程度(如變異是源自于低覆蓋的新一代測序, 還是通過了Sanger 測序驗證), 并分析用于評估數(shù)據(jù)準確度的各種指標, 要獲得這些信息可能需要閱讀相關的文獻; (iv)  確定收錄對象的來源及其唯一性。

變異解讀也需要檢索科學和醫(yī)學文獻。在參考一些采用舊的命名和分類系統(tǒng)或基于單一觀察結果的文獻時需要慎重。在參考攜帶某一變異并伴有相關表型的個體和家系的信息時, 考慮患者是如何被確診尤為重要。在評估這些文獻的數(shù)據(jù)時需要謹慎客觀, 這是由于受累患者及相關個體在基于不同背景和規(guī)模的研究中常常被多次重復報道。重復報道的發(fā)生可能是由于作者重疊、實驗室間合作或先證者及其家庭成員同時被不同臨床系統(tǒng)隨訪。而這些重復報道可能會導致受累個體被錯誤地重復計數(shù),  進而使變異頻率假性增高。作者或其研究機構互相重疊是發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集重復的第一線索。

臨床實驗室應建立一個內(nèi)部系統(tǒng)對已報告的基因序列變異及臨床診斷進行記錄。這對于分析基因型-表型之間的相關性, 以及該變異在患者和正常人群中的發(fā)生頻率尤為重要。臨床實驗室也應該積極提交變異數(shù)據(jù)到相關數(shù)據(jù)庫, 如 ClinVar 數(shù)據(jù)庫, 包含提交臨床評估信息以及用于變異分類的證據(jù), 以幫助人們不斷加深對人類遺傳變異所產(chǎn)生的效應的理解。在任何時候, 提供臨床數(shù)據(jù)應遵循“健康保險攜帶和責任法案 (HIPAA)”對個人隱私保護的規(guī)定。臨床實驗室應與臨床醫(yī)生合作, 以獲得臨床信息, 從而更好地理解基因型是如何影響臨床表型的, 并解決不同實驗室對遺傳變異解讀存在差異的問題。臨床變異數(shù)據(jù)庫極大地促進臨床實驗室工作的開展 , 因此需對其進行擴展并標準化。標準化便于臨床實驗室獲取數(shù)據(jù)庫的最新信息, 同時有助于提交更新的信息。例如, ClinVar 數(shù)據(jù)庫允許變異連同臨床表型和診斷相關信息一并提交, 同時追蹤提交變異的審核狀態(tài), 以便對?？辟|(zhì)量的水平提供一個更加透明的概貌。

2.4 生物信息學計算預測程序

各種公共和商業(yè)化計算機工具可以輔助解讀序列變異。每種工具使用的算法可能有差異, 但都會包含序列變異在核苷酸及氨基酸水平上作用影響的判斷, 包括變異對主要轉錄本, 可變轉錄本, 其他基因組元件影響作用的確認, 也包括對蛋白質(zhì)潛在影響作用的判定。這些工具主要分為兩類: 一類可以預測錯義變異是否會破壞蛋白質(zhì)的功能或結構; 另一種可以預測是否影響剪接(表2)。新的工具已可以處理額外的非編碼序列。

錯義改變的影響作用是由不同的條件決定的 , 例如一個氨基酸或核苷酸的進化保守性、其在蛋白質(zhì)序列中的位置及其上下游序列, 以及氨基酸置換導致的生化結果等。對各種計算機算法中的一個或幾個條件進行評測可以進一步評估錯義改變帶來的影 響。已經(jīng)有一些工作在評估預測軟件的預測性能,  是通過對這些預測軟件之間的相互比較評估他們預測已知致病突變的能力來實現(xiàn)的。一般情況下 ,多數(shù)算法預測已知致病的錯義突變的準確率能達到65%~80%。但是大多數(shù)工具的特異性較低, 導致有些錯義改變被過度預測為有害突變, 而且對于影響較小的錯義變異的預測也不可靠。目前臨床實驗室常用的錯義變異解讀工具有PolyPhen 2， SIFT和 MutationTaster。用于預測錯義變異的生物信息分析工具見表。

目前已開發(fā)出許多用于預測剪接的軟件, 這是基于內(nèi)含子或外顯子水平上剪接位點的丟失或產(chǎn)生原理基礎上而完成的。一般情況下,  相對于特異性(60%~80%), 預測工具在預測剪接位點異常方面具有較高的敏感性(~90%~100%)。一些常用的剪接位點預測分析計算工具見表2。

雖然許多不同的分析軟件程序使用不同的算法進行預測,  但其基本原理是相似的;  因此,  在序列解讀中, 不同軟件工具組合的預測結果被視為單一證據(jù)而不是相互獨立的證據(jù)。因為每個軟件工具基于他們使用的算法都各有優(yōu)缺點, 所以仍然建議使用多種軟件進行序列變異解讀;  很多情況下,  預測性可能因為基因和蛋白質(zhì)序列的不同而有差異。無論如何,  這些軟件分析結果只是預測,  他們在序列變異解讀中的應用應該慎重, 不建議僅使用這些預測結果 作為唯一證據(jù)來源進行臨床判斷。