免疫系統(tǒng)在腫瘤監(jiān)測和清除的進(jìn)程中起著非常重要的作用，腫瘤細(xì)胞在多種機(jī)制的幫助下做出免疫逃逸被認(rèn)為是癌癥進(jìn)展的標(biāo)志之一。作為免疫療法的重要代表，免疫檢查點(diǎn)抑制劑（Immune checkpoint inhibitor，ICI）對一些轉(zhuǎn)移性癌癥患者非常有益，但通常需要預(yù)測性生物標(biāo)志物來診斷患者。自腫瘤突變負(fù)荷（TMB）與免疫治療獲益之間的密切關(guān)系被揭示以來，圍繞TMB的研究也越來越豐富。去年10月，美國NCCN（綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)）將TMB正式列入非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）指南，最近一期的Nature Genetics雜志發(fā)表了一篇關(guān)于TMB的研究文章，為TMB作為免疫療法標(biāo)志物落下了“實(shí)錘”。

腫瘤微環(huán)境中的免疫應(yīng)答過程（圖片源自參考文章3）

以TMB作為標(biāo)志物臨床早已有應(yīng)用，在CTLA-4抑制劑治療黑色素瘤，PD-1/PD-L1抑制劑治療黑色素瘤、膀胱癌和NSCLC中均有觀察到高突變負(fù)荷TMB和臨床效益之間的關(guān)聯(lián)性。但既往研究ICI治療后TMB與生存率關(guān)系的臨床樣本量較小，目前對TMB是否具有各種癌癥臨床獲益的預(yù)測性尚無十足把握，也不清楚這種獲益一旦超出臨床特定試驗人群后是否還有效。為了獲得更廣泛地數(shù)據(jù)，這項最新研究共囊括1662名接受ICI治療晚期癌癥和5371名未接受ICI治療患者的臨床和基因組數(shù)據(jù)，并對這些患者的腫瘤采用了新一代靶向測序技術(shù)MSK-IMPACT。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有患者中，高TMB（不同腫瘤組織均值約20%）與較好的總生存期（OS）呈正相關(guān)，證明在大多數(shù)癌癥中，TMB升高與生存率提高之間存在相關(guān)性。

不同癌癥TMB的閾值與死亡危害比之間的關(guān)系（圖片源自參考文章2）

此外，該研究還對每個癌癥類型進(jìn)行了區(qū)別性分析，將每個組織學(xué)中突變負(fù)荷最高的前20%作為該癌癥類型的TMB高組。這樣操作的原因是TMB在不同組織學(xué)中分布不同，每種癌癥類型TMB前20%的閾值存在顯著差異，也就是說不可能有一個通用的閾值定義“何謂高TMB”，來預(yù)測ICI在所有癌癥類型中的臨床效益。這種不同腫瘤組織學(xué)的TMB差異以及對ICI應(yīng)答閾值的差異很可能是由于腫瘤微環(huán)境造成的，包括單克隆免疫滲透、免疫細(xì)胞排斥、人類白細(xì)胞抗原基因型變化和檢查點(diǎn)分子的表達(dá)水平等因素。

TMB程度在不同癌癥類型中的分布情況（圖片源自參考文章2）

這種分層研究更有利于觀察不同癌癥類型的OS與TMB的關(guān)聯(lián)，雖然可能由于樣本量的原因，對個別癌癥（如膠質(zhì)瘤）的影響沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義，但幾乎所有類型的癌癥都觀察到了高TMB與整體生存率較高的大趨勢，這些都說明TMB與ICI術(shù)后生存率提高之間的關(guān)系可能存在于大多數(shù)癌癥類型中。TMB在許多癌癥組織學(xué)上作為一個連續(xù)變量，在較長的OS中都能觀察到類似的標(biāo)志物關(guān)聯(lián)性趨勢。與OS的改善一致，在如NSCLC、黑色素瘤、食管胃癌、頭頸癌和腎細(xì)胞癌等類型中，TMB與ICI的客觀緩解率（ORR）或PFS之間也存在類似的相關(guān)性。

TMB程度與總生存期之間的關(guān)聯(lián)性（圖片源自參考文章2）

研究人員還對5371名轉(zhuǎn)移性癌癥并且沒有接受過ICI治療的患者腫瘤做了MSK-IMPACT測序，在這些患者中，TMB的升高與OS的提高沒有關(guān)聯(lián)性。這就排除了這種TMB與患者生存率的正關(guān)聯(lián)僅僅是由預(yù)后患者間的TMB差異導(dǎo)致的，而與ICI治療無關(guān)這樣一種可能。

這項研究成果解決了腫瘤免疫學(xué)中幾個重要的基本問題：一是驗證了突變負(fù)荷可以用來預(yù)測接受抗CTLA-4或抗PD-1治療患者的生存率。二是這項研究采用了迄今為止使用ICI治療的最大規(guī)?；颊呋蚪M數(shù)據(jù)，可以對TMB的臨床療效影響進(jìn)行量化分析，證明較高TMB與較高OS之間的持續(xù)相關(guān)性。最后，研究發(fā)現(xiàn)對“高”TMB的定義要因癌癥不同類型而異，很難用一個通用閾值來預(yù)測所有癌癥患者從ICI獲益的可能?？傊?，這一發(fā)現(xiàn)再次強(qiáng)調(diào)了TMB作為預(yù)測性生物標(biāo)志物的可靠性，具有重要的臨床價值。

TMB作為標(biāo)志物對ICI治療NSCLC的臨床獲益預(yù)測（圖片源自參考文章2）

鑒于免疫治療的潛在毒性和對ICI的高度可變反應(yīng)，以及這類療法的巨大經(jīng)濟(jì)成本，迫切需要能夠用來預(yù)測指導(dǎo)ICI用藥的陽性或陰性預(yù)測生物標(biāo)志物。陽性預(yù)測可以正確判斷哪些患者能夠產(chǎn)生治療響應(yīng)；而陰性預(yù)測用來確定哪些患者從當(dāng)前療法中無法獲益。利用生物標(biāo)志物可以對患者進(jìn)行單藥或聯(lián)合用藥的分組，或是決定將免疫療法用于不同患者群的一線和挽救治療，或是采用替代療法以避免不必要的毒性。除TMB外，目前已驗證具有免疫療法生物標(biāo)志物作用的有PD-L1表達(dá)、淋巴細(xì)胞浸潤水平、T細(xì)胞受體克隆性、外周血標(biāo)志物、免疫相關(guān)基因表達(dá)以及多路復(fù)用免疫組化等，下面簡要介紹一下。

在Nivolumab用于黑素瘤、NSCLC、腎細(xì)胞癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌的I期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，通過檢測腫瘤細(xì)胞的PD-L1表達(dá)可以作為抗PD-1、PD-L1治療的生物標(biāo)志物。將5%設(shè)定為腫瘤細(xì)胞PD-L1陽性閾值，在25例PD-L1陽性患者中有9例（36%）對Nivolumab出現(xiàn)ORR，陰性患者中沒有表現(xiàn)出ORR，在晚期黑色素瘤和NSCLC患者中陽性組比陰性組的PFS和OS也都有顯著提高，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)將PD-L1伴隨診斷用于晚期NSCLC和膀胱癌的治療。但是受PD-L1表達(dá)多機(jī)制調(diào)控和腫瘤微環(huán)境影響，PD-L1的表達(dá)具有取樣時間差異、患者個體差異、甚至瘤內(nèi)異質(zhì)性，其陰性預(yù)測作用要低很多。

盡管存在這些局限性，PD-L1表達(dá)在免疫療法確定受益患者群仍發(fā)揮著重要作用，特別是在相關(guān)臨床試驗中，確保PD-L1陽性腫瘤患者在比較群組中的平均分布是非常必要的，可以避免由生物學(xué)差異而引入的實(shí)驗偏差。

許多癌癥的回顧性研究都發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞的浸潤程度與患者生存率有關(guān)聯(lián)，在實(shí)體腫瘤聚集處，如結(jié)直腸癌和黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)異位淋巴結(jié)狀結(jié)構(gòu)能夠更好地預(yù)測患者生存。例如，與CD8 腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞程度較低的放化療III期NSCLC患者相比，腫瘤浸潤程度高的患者群PFS和OS都更長。這種淋巴細(xì)胞浸潤程度的背后機(jī)理被認(rèn)為是能夠激起自身免疫應(yīng)答或T細(xì)胞炎癥腫瘤表型，通過免疫機(jī)制改善疾病控制，因此可以作為預(yù)后生物標(biāo)志物。

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤的T細(xì)胞受體靶向腫瘤特異性免疫反應(yīng)，與Pembrolizumab的臨床應(yīng)答相關(guān)，結(jié)果表明基線T細(xì)胞受體克隆性與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞密度的相關(guān)性不高。當(dāng)浸潤淋巴細(xì)胞限制了T細(xì)胞受體對腫瘤抗原的特異性克隆，即便是腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞密度較低的患者，仍然可以在抗PD-1治療中獲益。當(dāng)然這種假設(shè)尚需要從大量臨床試驗中得到進(jìn)一步驗證，并且可能還需要確認(rèn)可識別的腫瘤抗原，然后才能將該方法應(yīng)用于生物標(biāo)志物。

外周血標(biāo)志物的優(yōu)勢在于非侵入性的樣品采集方式，雖然這類標(biāo)志物與臨床療效的一些關(guān)聯(lián)性已有研究，但是尚未有這類標(biāo)志物真正“落地”具備療法預(yù)測性。以Ipilimumab為例，相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)以下指標(biāo)與患者PFS有關(guān)，包括低絕對中性粒細(xì)胞計數(shù)(< 7500個細(xì)胞/μL)，中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比例低(< 3)，絕對的單核細(xì)胞計數(shù)低(< 650細(xì)胞/μL)，低頻髓樣抑制細(xì)胞(< 5·1%)、高頻FoxP3 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(≥1·5%)，高頻率的淋巴細(xì)胞(≥10·5%)，以及高嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)(≥50個細(xì)胞/μL)，在抗PD-1治療研究中也發(fā)現(xiàn)了一些類似的結(jié)果。此外，外周T細(xì)胞數(shù)量，尤其是T細(xì)胞受體基因序列或?qū)π驴乖姆磻?yīng)性評估也可以作為一種預(yù)測生物標(biāo)志物發(fā)揮潛在作用。

通過基因表達(dá)對腫瘤微環(huán)境中活躍的先天或適應(yīng)性免疫反應(yīng)進(jìn)行更廣泛的評估，可以有效地預(yù)測ICI療法的臨床效益。對晚期黑色素瘤患者使用Ipilimumab的II期臨床回顧性分析證明，基因表達(dá)譜圖確實(shí)是一種有用的預(yù)測生物標(biāo)志物。研究人員提取了50份治療前腫瘤活檢標(biāo)本的總RNA進(jìn)行分析，將患者分為有臨床應(yīng)答和無應(yīng)答兩組，對兩組之間存在顯著差異的基因進(jìn)行通路分析后發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)炎癥反應(yīng)。22個與免疫相關(guān)的基因表達(dá)至少增加了2·5倍，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞（如CD8A、顆粒酶B、穿孔蛋白I）、Th1細(xì)胞因子或趨化因子、MHCII類和其他免疫相關(guān)基因(如NKG7、IDO1)的標(biāo)志物，均與OS延長相關(guān)。

通過多重免疫組化技術(shù)直接評價腫瘤和免疫細(xì)胞表型及其空間關(guān)系，提供了腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)的信息，這些信息可以作為基因表達(dá)譜的補(bǔ)充。包括用單個初級抗體對腫瘤切片進(jìn)行連續(xù)染色，以獲得感興趣的蛋白質(zhì)，并用顯色或免疫熒光法進(jìn)行檢測，這種多光譜方法在臨床應(yīng)用中具有很大的潛力。通過建立多光譜免疫組化平臺，分析黑色素瘤載片上的CD3、CD8、FoxP3、CD163和PD-L1，預(yù)測哪些患者能夠成功生成腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，選擇合適的細(xì)胞療法。僅CD8 T細(xì)胞的存在不足以預(yù)測腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的成功生長，但是CD8 T細(xì)胞與CD3 FoxP3 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比值與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的成功生長密切相關(guān)。PD-L1 的加入使陰性預(yù)測值提高了100%，這種方法也可以應(yīng)用于其他免疫療法。

將兩種或兩種以上標(biāo)志物策略聯(lián)合使用來捕捉腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)，可以對ICI治療更有效。以PD-L1表達(dá)和淋巴細(xì)胞浸潤為例，兩者可能在腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)相反的情況，PD-L1表達(dá)較高時腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞計數(shù)較低，反之亦然，在這種情況下，抗PD-1或抗PD-L1單一治療的臨床響應(yīng)可能較低，而僅以PD-L1表達(dá)或腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞密度作為生物標(biāo)志物，會產(chǎn)生錯誤的預(yù)測。同樣，并非所有高突變或新抗原負(fù)荷腫瘤都表現(xiàn)出“先天”的免疫性，這被認(rèn)為是免疫治療方法的先決條件之一。腫瘤微環(huán)境中還存在多種并發(fā)免疫抑制機(jī)制，包括CTLA-4、PD-L2、LAG3、IDO1和IL-10，隨著新的聯(lián)合治療策略的出現(xiàn)，這些都可能成為重要的識別靶點(diǎn)。

參考文章：

[1]BMS Withdraws Application for Nivolumab/Ipilimumab in TMB-High NSCLC.

[2]Tumor mutational load predicts survival after immunotherapy across multiple cancer types.

[3]Predictive biomarkers for checkpoint inhibitorbased immunotherapy.

[4]Approaches to treat immune hot, altered and cold trumors with combination immunotherapies.