解螺旋公眾號·陪伴你科研的第1777天

今天就以發(fā)表在Nature Genetics這篇“Long noncoding RNA MALAT1 suppresses breast cancer metastasis”文章為切入點，說的是lncRNA MALAT1抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移，問題是大部分文章是說MALAT1促進乳腺癌等腫瘤的轉(zhuǎn)移。

到底哪里出問題了呢? 之所以會出現(xiàn)促進轉(zhuǎn)移的表型，是因為MALAT1這個基因的位置位于臨近基因（NEAT1，F(xiàn)RMD8）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，當我們通過基因敲除的方法把這段MALAT1基因的序列敲掉后，不僅會敲除 MALAT1基因，其臨近基因的表達也會受到影響。

目前大多數(shù)的功能性研究都集中在使用siRNAs、shRNAs或者ASOs，這些RNAs只能干擾已經(jīng)生成的RNA轉(zhuǎn)錄本，不能有效的消耗lncRNA的靶標，并且可能產(chǎn)生一些意想不到的后果。siRNAs/shRNAs主要在細胞質(zhì)中活化來介導RNAi，而lncRNA的靶標通常在核里。

此外，越來越多的證據(jù)表明siRNAs/shRNAs可通過轉(zhuǎn)錄基因沉默改變細胞核中的轉(zhuǎn)錄。因此，使用siRNAs/shRNAs產(chǎn)生的功能性結果可以通過染色質(zhì)的表觀遺傳沉默和/或RNA聚合酶II活性的降低來間接介導，這種作用效果的不確定性增加了研究者對ASO介導方法的偏好。

現(xiàn)有研究表明，ASO是通過RNaseH依賴性機制引發(fā)細胞核中RNA的降解（如下圖所示），并且尚未有報道指出這種機制可以改變?nèi)旧|(zhì)的結構。因此，當前實驗方法的局限性阻礙了lncRNA轉(zhuǎn)錄過程中的作用與lncRNA本身分子作用的全面分離。

為了阻斷轉(zhuǎn)錄，許多研究采用了RNA聚合酶II起始或延伸的抑制劑，但這些抑制劑往往也會抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，因此它們在功能研究中的用途就受到了限制。

目前，基于啟動子缺失和插入轉(zhuǎn)錄終止位點的基因編輯技術，使用序列特異性核酸酶，如鋅指酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應核酸酶（TALENs）或CRISPR/Cas9是非常有前景的研究lncRNA功能的方法。

前面提到的“Long noncoding RNA MALAT1 suppresses breast cancer metastasis”中作者采用CRISPR方法在基因組上引入終止子（如下圖所示），從而可以更真實的反應MALAT1本身的生物學功能。

而調(diào)節(jié)位點的deletion是不能夠區(qū)分是DNA序列的作用還是由該區(qū)域產(chǎn)生的lncRNA的作用。因此，在基因組上引入終止位點可能是研究lncRNA比較有前景的方法，而對于eRNA (Enhancer RNA)，其合成往往是在轉(zhuǎn)錄起始位點的下游終止，所以這種方法也不會改變大多數(shù)eRNA的產(chǎn)生。

近年來，CRISPR interference (CRISPRi) 和CRISPR activation (CRISPRa)基于核酸酶活性失活的Cas9 (dCas9)與效應結構域 (干擾或激活)融合，這項技術將為研究ncRNA提供更好的手段。此外，通過對RNA聚合酶II形成空間位阻，單獨使用dCas9而不與效應結構域融合來實現(xiàn)的CRISPRi可以在不改變局部染色質(zhì)結構的基礎上來研究ncRNA轉(zhuǎn)錄的作用。

然而，盡管有很多工具可用，但是迄今為止尚未開發(fā)出用于阻止特定位點的轉(zhuǎn)錄而不影響該區(qū)域的其他特征的好方法?？傊瑸榱说玫娇煽康膶嶒灲Y果，我們應該使用多種不同的方法來進行功能缺失實驗，做下游靶基因或者臨近基因的改變的話，需要通過Rescue實驗進一步驗證，以確保得到科學的結論。

下圖是對研究lncRNA所使用的策略總結，還有每種策略的局限性：

技術推動科學的發(fā)展，在科學研究的道路上還需要我們不斷創(chuàng)新開發(fā)更好的工具來探索生命科學的奧秘，大家努力加油吧！

附：關于lncRNA敲減策略選擇

關于lncRNA干擾策略問題，雖然siRNAs/shRNAs/ASO已經(jīng)成功地用于干擾特定的lncRNA，但每種方法對于不同的lncRNA起到的干擾效果可能會有所不同。首先要考慮的就是lncRNA的亞細胞定位。

如下Fig.1所示，針對于細胞核定位的兩種lncRNA (MALAT1和NEAT1)，使用ASO明顯比siRNA起到更好的抑制效果；針對于細胞質(zhì)定位的lncRNA (DANCR和OIP5-AS1)，如Fig.2所示，siRNA發(fā)揮出了明顯的優(yōu)勢；而對于細胞核和細胞質(zhì)都有定位的lncRNA (YUG1、CasC7、HOTAIR)，單獨使用siRNA或ASO都沒有前面兩種效果好(Fig.3)。

Fig.1

Fig.2

Fig.3

但是，聯(lián)合使用siRNA和ASO卻能達到很好的敲低效果，并且針對于單純細胞核定位或是細胞質(zhì)定位的lncRNA而言，ASO和siRNA一起使用都比單獨使用有更好的干擾效果（圖4）。有趣的是，對細胞質(zhì)定位的lncRNA采用ASO敲低可能比siRNA作用于細胞核定位的lncRNA更為有效(如圖5)提示我們細胞質(zhì)中RNaseH1的活性水平可能高于我們先前了解的水平。最近研究表明轉(zhuǎn)染ASO后，mRNA降解的限速步驟與RNaseH1的數(shù)量有關，進一步表明了在細胞核和細胞質(zhì)中都有RNaseH1活性。

Fig.4

Fig.5

總之，當我們要干擾lncRNA時，首先考慮其定位，反義寡核苷酸ASO用于細胞核定位lncRNA，RNAi用于細胞質(zhì)定位lncRNA，當lncRNA定位未知時，如果只用一種方法的話，優(yōu)先選用ASO敲低可能會更好，聯(lián)合使用ASO和RNAi往往會達到比單一方法更有效的敲低效果，這種聯(lián)合方法又特別適用用核質(zhì)雙定位的lncRNA。

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