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我們實(shí)驗(yàn)室有句話口口相傳：做上 WB，走上不歸路。WB 難，磷酸化蛋白的 WB 就更難了。做為在磷酸化蛋白上摸爬滾打多年的老司機(jī)，總結(jié)了一些經(jīng)驗(yàn)，希望能助各位科研民工們一臂之力，少走彎路，早日出結(jié)果發(fā) paper，迎娶白富美，走向人生巔峰?。?！（文末開學(xué)豪禮等著你） Q1: 什么是蛋白質(zhì)磷酸化？ 磷酸化是將磷酸基團(tuán)加在中間代謝產(chǎn)物上或加在蛋白質(zhì)上的過程。 Q2: 蛋白質(zhì)磷酸化的作用？ 蛋白質(zhì)磷酸化對(duì)于許多生物現(xiàn)象的引發(fā)是很必要的，包括細(xì)胞生長、增殖、泛素介導(dǎo)的蛋白降解等過程。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活動(dòng)都是由一系列蛋白傳遞鏈構(gòu)成的，信號(hào)傳導(dǎo)的過程中涉及到多種蛋白質(zhì)的可逆磷酸化過程。蛋白質(zhì)通過可逆磷酸化，以及不同的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可以將信號(hào)放大傳遞等。由此可見蛋白質(zhì)磷酸化在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中擔(dān)負(fù)著重要的作用。 Q3: 檢測(cè)蛋白質(zhì)是否磷酸化以及磷酸化水平的常用方法？ Western blot 是評(píng)估蛋白磷酸化狀態(tài)的最常用方法，利用 SDS-PAGE 分離蛋白樣品，隨后轉(zhuǎn)移到印跡膜上，之后利用磷酸化特異性抗體來鑒定目的蛋白。 有人會(huì)說 western blot 還不好做嗎？那可是研究生的技能標(biāo)配，但是磷酸化蛋白的 western blot 就不能小看了，多少人在這里摸爬滾打，絞盡腦汁。下面重點(diǎn)來了，趕緊搬個(gè)小板凳認(rèn)真學(xué)起來。 想跑出好的磷酸化蛋白條帶，與做普通的 Western Blot 相比，磷酸化 Western Blot 有一些要額外需要注意的事項(xiàng)： 01 檢測(cè)樣本是否表達(dá)目的蛋白 實(shí)驗(yàn)前需先查閱文獻(xiàn)或通過預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該樣本是否表達(dá)目的磷酸化蛋白，若正常情況下樣本的磷酸化水平過低或不表達(dá)，可通過物理或化學(xué)方法進(jìn)行一定的刺激和誘導(dǎo)，正確的刺激會(huì)幫助得到最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 02 檢測(cè)總蛋白是否有變化 封檢測(cè)磷酸化蛋白之外，往往也需要檢測(cè)總蛋白。僅僅是檢測(cè)到磷酸化蛋白表達(dá)量的升高或降低并不能說明問題，只有磷酸化蛋白與總蛋白比值增加或減少了才能說明磷酸化水平的變化。 03 點(diǎn)樣時(shí)加入 Marker 做磷酸化蛋白 Western blot 時(shí)，除了目標(biāo)蛋白的條帶以外，往往會(huì)出現(xiàn)非特異性的條帶。如果磷酸化抗體不佳，甚至只有非特異性的條帶，而沒有目的條帶。所以點(diǎn)樣時(shí)需同時(shí)加入合適分子量范圍的 Marker，根據(jù) Marker 進(jìn)行比對(duì)，查看條帶的分子量，是否是目的條帶。否則有可能會(huì)誤以為一些非特異條帶是目的帶，白白耗費(fèi)了大量精力得出錯(cuò)誤的結(jié)果。 04 抑制磷酸酶的干擾 由于蛋白的磷酸化是可逆的，會(huì)被磷酸酶去磷酸化，所以在樣品制備和整個(gè)檢測(cè)過程中，需要抑制或避免細(xì)胞內(nèi)源性和外源性的磷酸酶的干擾。針對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性的磷酸酶，在樣品制備時(shí)，需要在裂解液中加入足量的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。外源性的磷酸酶主要是由實(shí)驗(yàn)過程中的其它試劑帶入的，比如要確保實(shí)驗(yàn)試劑中不含磷酸酶等；此外，樣品中或其它試劑中帶的細(xì)菌也會(huì)分泌外源性的磷酸酶，所以另一個(gè)關(guān)鍵是要盡量使用無菌清潔的試劑和凝膠，必要時(shí)加入防腐劑。 所謂細(xì)節(jié)決定成敗，除了以上注意事項(xiàng)，操作細(xì)節(jié)尤其重要，稍不注意就會(huì)事倍功半，這就是為什么很多小伙伴在做磷酸化蛋白的 WB 實(shí)驗(yàn)時(shí)，很疑惑明明按照步驟操作的，為什么結(jié)果還是不理想，所以大家一定要注意以下細(xì)節(jié)。 磷酸化蛋白容易脫磷酸化，除提取蛋白時(shí)要迅速小心外，也可在上樣緩沖液和轉(zhuǎn)移緩沖液中加入磷酸化酶抑制劑 Na3VO4 等。  只要按照以上注意事項(xiàng)操作，小白也會(huì)成為實(shí)驗(yàn)小達(dá)人，做出理想的磷酸化蛋白條帶。最后向還在跑 Western 的同學(xué)們致敬，條帶會(huì)有的，文章會(huì)有的，開學(xué)豪禮也會(huì)有的 關(guān)注博士德公眾號(hào) boster-1993 即可參與活動(dòng) 文章及題圖來源：博士德 |
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