黃精為百合科黃精屬植物滇黃精Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.、黃精P. sibiricumRed. 或多花黃精P. cyrtonema Hua的干燥根莖。具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎的功效^[1]。黃精主要成分有多糖、甾體皂苷、蒽醌、黃酮及氨基酸類等。以其炮制品酒黃精用于臨床，通過炮制以消除其麻味，減輕對(duì)咽喉的刺激，并增強(qiáng)補(bǔ)脾潤(rùn)肺、益腎作用^[2]。黃精采用蒸法炮制，藥材本身含有大量的糖類和氨基酸類成分，筆者在前期研究中，在酒黃精薄層色譜中檢識(shí)到Maillard反應(yīng)標(biāo)志性產(chǎn)物5-羥甲基糠醛^[3]，提示黃精炮制過程可能發(fā)生Maillard反應(yīng)。

Maillard反應(yīng)是指氨基化合物和羰基化合物之間發(fā)生的非酶促反應(yīng)^[4]，反應(yīng)過程非常復(fù)雜，會(huì)產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的小分子和大分子的Maillard反應(yīng)產(chǎn)物（MRPs）^[5]。反應(yīng)伴隨物理化學(xué)特征如顏色變化^[6]和pH值降低^[7]。反應(yīng)體系顏色的變化常采用UV-vis法分析，通過280 nm吸光度值表征產(chǎn)物特征^[8-9]。隨著MRPs的生成反應(yīng)體系酸度降低，因此pH檢測(cè)也是確定Maillard反應(yīng)發(fā)生的重要指標(biāo)。GC-MS法是最常用的分析MRPs小分子化合物的方法^[10]。研究表明，MRPs具有抗氧化活性，通常使用比色法檢測(cè)MRPs對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的清除率，以表征其抗氧化活性^[11]。

目前《中國(guó)藥典》2015年版中黃精和酒黃精均采用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)，特異性不足。同時(shí)，黃精炮制缺乏規(guī)范性，全國(guó)各地黃精炮制時(shí)間不等^[12-14]。本實(shí)驗(yàn)從黃精酒炙過程中Maillard反應(yīng)物理化學(xué)特征、小分子MRPs以及抗氧化活性角度，確定黃精酒炙發(fā)生Maillard反應(yīng)，并對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物和抗氧化活性隨炮制過程的變化進(jìn)行分析，尋找黃精與酒黃精差異性成分，以期為黃精與酒黃精質(zhì)量評(píng)價(jià)方法和炮制規(guī)范提供基礎(chǔ)。

1  儀器與材料

Agilent 8453紫外可見分光光度計(jì)，美國(guó)Agilent公司；GC-MS-QP2010型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；Rxi-5ms石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），美國(guó)Restek公司；3520型便攜式酸度計(jì)，英國(guó)Jenway公司；FW-80微型高速萬能試樣粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；TCQ-250超聲波清洗器，北京醫(yī)療設(shè)備二廠；CP225D電子天平，220 g/0.01 mg，德國(guó)Sartorius公司；超純水系統(tǒng)，美國(guó)Thermo Scientific公司。

C₈～C₂₀正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品購自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)1443129；氦氣購自北京兆格氣體科技有限公司；二氯甲烷，分析純。紹興黃酒，瓜渚湖黃酒，紹興縣第三酒廠，2010.11.20生產(chǎn)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），美國(guó)Sigma公司；還原型谷胱甘肽（批號(hào)140706-200702，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.9%）對(duì)照品為含量測(cè)定用，購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；其他試劑均為分析純。3個(gè)品種的黃精鮮品均采自貴州省黔西南布依族苗族自治州興仁縣，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉春生教授鑒定，分別為百合科植物滇黃精Polygonatum kingiaum Coll. et Hemsl.、黃精P. sibiricumRed. 和多花黃精P. cyrtonema Hua的根莖，曬干。

2  方法與結(jié)果

2.1  炮制品制備^[1]

黃精除去雜質(zhì)，洗凈，略潤(rùn)，切厚片（2～4 mm），烘箱50 ℃吹風(fēng)干燥，即得。

酒黃精為取上述黃精飲片，加黃酒（100 kg黃精用黃酒20 kg），拌勻，悶潤(rùn)過夜至酒吸盡，置適宜容器內(nèi)，隔水加熱，分別燉至不同時(shí)間取出，干燥，即得。

2.2  供試品溶液的制備

取各供試品粉末（過60目篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入二氯甲烷100 mL，稱定質(zhì)量，30 ℃以下超聲處理（功率250 W，頻率30 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用二氯甲烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，得到二氯甲烷組分。根據(jù)各項(xiàng)分析需要，適當(dāng)稀釋或濃縮。

2.3  紫外-可見光吸光度測(cè)定

2.3.1  黃精吸光度隨炮制不同時(shí)間的變化  以多花黃精為研究對(duì)象，對(duì)不同炮制時(shí)間黃精二氯甲烷組分的紫外吸收光譜變化進(jìn)行研究。取供試品溶液，以溶劑為空白，在紫外區(qū)200～400 nm掃描，最大吸收波長(zhǎng)280 nm處測(cè)吸光度（A₂₈₀）值結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，多花黃精二氯甲烷組分A₂₈₀隨炮制時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

2.3.2  不同品種黃精A值變化  全國(guó)各地黃精炮制時(shí)間為12～24 h^[12-14]，因此對(duì)《中國(guó)藥典》2015年版收載3個(gè)品種滇黃精、黃精及多花黃精炮制相同時(shí)間（16 h），得到不同品種酒黃精，測(cè)定二氯甲烷組分A₂₈₀，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，《中國(guó)藥典》2015年版收載的3個(gè)品種黃精經(jīng)炮制16 h后，A₂₈₀都增加，顯示Maillard反應(yīng)特征，但各品種增加的幅度不同。來源于滇黃精、黃精和多花黃精的黃精，炮制16 h得到的酒黃精A₂₈₀分別是生品的1.6、15.7、2.7倍。顯示各品種黃精存在一定的成分差異。

2.4  pH值變化

2.4.1  黃精炮制不同時(shí)間二氯甲烷組分pH值變化  采用酸度計(jì)測(cè)定不同炮制時(shí)間多花黃精二氯甲烷組分pH值，精確至±0.01，結(jié)果見圖1。隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，多花黃精二氯甲烷組分pH值呈降低的趨勢(shì)，由生品的4.66，降至16 h時(shí)最低的3.43，隨后變化緩慢。

2.4.2  不同品種黃精炮制相同時(shí)間后二氯甲烷組分pH值變化  以來源于滇黃精、黃精及多花黃精的樣品為研究對(duì)象，對(duì)這3個(gè)品種黃精炮制相同時(shí)間（16h）酒黃精二氯甲烷組分的pH值變化進(jìn)行了研究。表3顯示，3個(gè)品種黃精炮制16 h得到的酒黃精，二氯甲烷組分pH值與生品比較都呈現(xiàn)酸性變化趨勢(shì)。但各品種變化程度不同，多花黃精變化幅度最大，顯示品種之間存在成分差異。

2.5  GC-MS法分析黃精小分子MRPs

2.5.1  GC-MS色譜條件

（1）氣相色譜條件：Restek Rxi-5ms石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為220 ℃；程序升溫：起始溫度為41 ℃，以10 ℃/min升至160 ℃，保留1 min，再以5 ℃/min升至250 ℃，保留2 min，再以8 ℃/min升至300 ℃，再保留8 min；進(jìn)樣量為4 μL，分流比為1∶20，載氣為氦氣。

（2）質(zhì)譜條件：電離方式為EI，離子源溫度200 ℃，接口溫度為220 ℃，電子能量70 eV，電離電壓1 760 V，質(zhì)量掃描范圍m/z45～550。按上述氣相及質(zhì)譜條件對(duì)供試品分析，得其總離子流圖，見圖2。

2.5.2  GC-MS分析 對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到各組分的質(zhì)譜圖，經(jīng)過質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)檢索系統(tǒng)（質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST05.LIB、NIST05s. LIB、NIST08.LIB、NIST08s.LIB和Wiley9.LIB）僅計(jì)算匹配度大于80%的鑒定結(jié)果，同時(shí)參考C₈～C₂₀正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品在此實(shí)驗(yàn)條件下的保留指數(shù)（retentionindex，RI）^[15]，用峰面積歸一化法計(jì)算樣品中各組分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而確定黃精和不同炮制時(shí)間酒黃精中的化學(xué)成分以及各化學(xué)成分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。從黃精與4、8、16、24、32 h酒黃精中，分別鑒定出15、17、18、18、25、22個(gè)化合物。這些化合物為雜環(huán)類、酸類、酯類、烷烴類、醇類、酮類和烯烴類等。黃精與不同炮制時(shí)間酒黃精共同含有12個(gè)化合物。5個(gè)不同炮制時(shí)間酒黃精共新產(chǎn)生了15個(gè)化合物（表4），其中4、8、16、24、32 h酒黃精分別有5、6、6、13、10個(gè)。依據(jù)成分含量隨炮制時(shí)間的變化趨勢(shì)可分為3類：第1類成分隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)含量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)的化合物有4個(gè)，包括正己酸、3-羥基二氫-2(3H)-呋喃酮、4-羥基二氫-2(3H)-呋喃酮和5-羥甲基糠醛；第2類成分先升高后下降的化合物為3,5-二羥基-6-甲基-2,3-二氫-4H-吡喃-4-酮、4-甲基-2,6-二叔丁基苯酚和2-乙基己基草酸己酯；第3類成分呈現(xiàn)起伏變化，為乙基鄰苯二甲酸酯、乙基亞油酸酯和2-乙基己基草酸己酯。

參考文獻(xiàn)方法^[16]，采用無水乙醇配制DPPH 0.1 mmol/L溶液，避光保存。取適量供試品溶液2 mL加入具塞試管中，加入DPPH溶液2 mL，搖勻，密閉放置30 min后，以80%乙醇溶液為空白，在517 nm處測(cè)定其吸光度（A₂）；取供試品溶液2 mL加入具塞試管中，加入80%乙醇溶液2 mL，搖勻，密閉放置30 min后，測(cè)定其吸光度（A₀）；取80%乙醇溶液2 mL加入具塞試管中，加入DPPH溶液2 mL，搖勻，密閉放置30 min后，測(cè)定其吸光度（A₁）；按照清除率＝1－(A₂－A₀)/A₁計(jì)算清除率，清除率越大，抗氧化能力越強(qiáng)。

相同生藥質(zhì)量濃度（40 mg/mL）的多花黃精及不同炮制時(shí)間的酒黃精DPPH自由基清除率結(jié)果（圖3）顯示，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，二氯甲烷組分DPPH自由基清除率呈遞增趨勢(shì)，黃精清除率為33.31%，炮制至16 h達(dá)到最高為67.21%，隨后炮制24 h和32 h趨于穩(wěn)定。

不同質(zhì)量濃度的多花黃精及其16 h酒黃精的二氯甲烷組分DPPH自由基清除率結(jié)果（表5）顯示，酒黃精二氯甲烷組分DPPH清除率隨生藥量的增加而增加；黃精DPPH半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）值為64.24 mg/mL，酒蒸16 h后的為23.41 mg/mL。IC₅₀值越低，抗氧化能力越強(qiáng)，可見酒黃精的抗氧化能力強(qiáng)于黃精。

相同生藥質(zhì)量濃度（40 mg/mL）的不同品種黃精炮制16 h后酒黃精，DPPH自由基清除率變化（表6）顯示，經(jīng)炮制后，滇黃精DPPH自由基清除率從18.89%增加至49.20%（P＜0.05），黃精從36.89%增加至68.58%（P＜0.05），多花黃精從33.21%增加至66.16%（P＜0.05），3個(gè)品種黃精的二氯甲烷組分DPPH自由基清除率均明顯增加。

3  討論

3.1  Maillard反應(yīng)物理化學(xué)特征分析

Maillard反應(yīng)中間產(chǎn)物的紫外特征吸收波長(zhǎng)是280 nm或294 nm^[8,17]。根據(jù)全波長(zhǎng)掃描結(jié)果，選取最大吸收波長(zhǎng)280 nm作為黃精及酒黃精的檢測(cè)波長(zhǎng)。黃精及酒黃精的二氯甲烷組分在280 nm波長(zhǎng)下的紫外吸光結(jié)果顯示，黃精經(jīng)炮制后A₂₈₀增加，且隨炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，A₂₈₀呈遞增的趨勢(shì)。表明黃精炮制過程中Maillard反應(yīng)中間產(chǎn)物增加。滇黃精、黃精和多花黃精3個(gè)品種黃精炮制相同時(shí)間A₂₈₀分別是生品的1.6、15.7、2.7倍，顯示不同變化程度，可能與3個(gè)品種黃精的化學(xué)成分差異有關(guān)，因?yàn)镸RPs與反應(yīng)底物糖及氨基酸、反應(yīng)條件等密切相關(guān)^[18]。

有研究以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，考察黃精中含量最高的氨基酸纈氨酸與葡萄糖/果糖發(fā)生Maillard反應(yīng)時(shí)時(shí)間、溫度、初始pH值和氨基與羰基物質(zhì)的量比的影響，結(jié)果纈氨酸與2種單糖呈現(xiàn)了不同的最佳反應(yīng)條件^[19]。同時(shí)，黃精炮制后280 nm波長(zhǎng)紫外A值的變化除了與MRPs有關(guān)，也可能與黃精中其他成分在炮制過程中的變化相關(guān)，還需要深入研究確定。

體系酸度降低是Maillard反應(yīng)的特征^[20]。黃精炮制過程中二氯甲烷組分的pH值測(cè)定結(jié)果顯示，黃精炮制后pH值降低，且隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)而呈遞減趨勢(shì)。Maillard反應(yīng)過程中pH值降低，是由于氨基酸的堿性基團(tuán)-氨基在加熱過程中不斷地與還原糖的羰基進(jìn)行縮合，使得游離的氨基被封閉，致使體系的pH值不斷下降^[21]。當(dāng)達(dá)到偏酸環(huán)境時(shí)，pH值下降速度減緩，因?yàn)橹虚g階段產(chǎn)生了緩沖液，包括有機(jī)酸、乙酰丙酸、丙酮酸等^[22]。因此，推測(cè)黃精在炮制16 h后Maillard反應(yīng)速率降低。

3.2  炮制后MRPs分析

二氯甲烷是最常用的提取小分子MRPs的溶劑。Maillard反應(yīng)很復(fù)雜，可產(chǎn)生不同種類的MRPs，起始階段形成Amadori化合物^[23]，中間階段產(chǎn)生呋終產(chǎn)物是蛋白黑素類^[23]。分析顯示，黃精炮制既有新的成分產(chǎn)生，也有之前存在成分的消失，同時(shí)，各成分比例也發(fā)生了變化。具有MRPs特征的成分有3-羥基二氫-2(3H)-呋喃酮、4-羥基二氫-2(3H)-呋喃酮、5-羥甲基糠醛、3,5-二羥基-6-甲基-2,3-二氫- 4H-吡喃-4-酮。后2個(gè)成分是Maillard反應(yīng)標(biāo)志性成分^[25]，在何首烏炮制品制何首烏中也檢測(cè)到這2個(gè)成分^[26]。5-羥甲基糠醛是16、24、32 h酒黃精中占比最高的成分。反應(yīng)產(chǎn)物在黃精及酒黃精質(zhì)量評(píng)價(jià)的應(yīng)用，還需深入研究。

3.3  炮制后抗氧化活性變化

研究表明大多數(shù)MRPs都具有抗氧化活性^[27]，而檢測(cè)DPPH自由基的清除情況，可以評(píng)價(jià)樣品的抗氧化活性，清除率越大，抗氧化活性越強(qiáng)。結(jié)果顯示，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，多花黃精二氯甲烷組分DPPH自由基清除率呈遞增趨勢(shì)，至16h達(dá)到最高然后趨于平穩(wěn)。

多花黃精及其16 h酒黃精的二氯甲烷組分DPPHIC₅₀比較顯示，黃精炮制后IC₅₀值降低，抗氧化活性增強(qiáng)；3個(gè)品種黃精經(jīng)炮制后，其二氯甲烷組分的DPPH自由基清除率明顯增強(qiáng)。Maillard反應(yīng)中產(chǎn)生的一些小分子揮發(fā)性物質(zhì)具有抗氧化活性，Eiserich等^[28]發(fā)現(xiàn)二氯甲烷提取的半胱氨酸與葡萄糖的MRPs中，有3種物質(zhì)都擁有抗氧化活性，主要是噻唑類和呋喃酮類化合物。Maillard反應(yīng)產(chǎn)生的一些揮發(fā)性產(chǎn)物，比如吡咯和吡嗪等都表現(xiàn)出了較好的抗氧化活性^[29-30]。

綜上，研究結(jié)果提示黃精在炮制過程中發(fā)生了Maillard反應(yīng)，使得酒黃精中含有特征性的MRPs 2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、5-羥甲基糠醛等。隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，酒黃精抗氧化活性增強(qiáng)，至16 h達(dá)到最高隨后趨于穩(wěn)定。研究為黃精與酒黃精質(zhì)量控制與炮制工藝規(guī)范化提供參考。

參考文獻(xiàn)（略） 

來  源：王  淳，宋志前，寧張弛，梁東蕊，馬新玲，萬曉瑩，劉振麗. 黃精炮制二氯甲烷組分Maillard反應(yīng)產(chǎn)物及抗氧化活性研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(3):604-610.