Fc 融合蛋白是指利用基因工程等技術(shù)將某種具有生物活性的功能蛋白分子與 Fc 片段融合而產(chǎn)生的新型重組蛋白，其不僅保留了功能蛋白分子的生物學(xué)活性，還具有一些抗體的性質(zhì)，如通過結(jié)合相關(guān) Fc 受體延長半衰期和引發(fā)抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒性效應(yīng)等。

抗體類藥物是當(dāng)前藥物研發(fā)的重點和熱點，通常能較快獲得上市許可，并帶來較大的商業(yè)成功。進入21 世紀(jì)以來，美國 FDA 和歐洲藥物管理局（European Medicines Agency，EMA）總共批準(zhǔn)了約 20 種抗體類藥物。借助傳統(tǒng)抗體的成功平臺，一種基于抗體結(jié)構(gòu)，將蛋白或多肽與免疫球蛋白 Fc 片段相融合的新功能重組蛋白也獲得了一定的發(fā)展。

Fc融合蛋白是指利用基因工程等技術(shù)將某種具有生物學(xué)活性的功能蛋白分子與Fc 片段融合而產(chǎn)生的新型蛋白，功能蛋白可以是能結(jié)合內(nèi)源性受體（或配體）的可溶性配體（或受體）分子或其他需要延長半衰期的活性物質(zhì)（如細胞因子）。該類融合蛋白不僅保留了功能蛋白分子的生物學(xué)活性，并且還具有一些抗體的性質(zhì)，如長效半衰期。例如，普通重組 IL-2 體內(nèi)半衰期僅為 6.9 min，而重組 IL-2/Fc 融合蛋白體內(nèi)循環(huán)半衰期則延長了近700倍。

1 Fc 融合蛋白的類別

根據(jù)是否需要發(fā)揮 Fc 段結(jié)合 FcγR 來介導(dǎo)抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒性（antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity，ADCC）或結(jié)合補體 C1q 來介導(dǎo)補體依賴的細胞毒性（complement-dependent cytotoxicity， CDC）等的生物學(xué)活性，可將 Fc 融合蛋白分為溶細胞性（cyto-lytic）和非溶細胞性（non-lytic）。前者由功能性蛋白與天然或活性提高的 Fc 片段融合而成，不僅具有功能蛋白的生物學(xué)活性和長效血漿半衰期，并且保留了 Fc 段介導(dǎo) ADCC 及 CDC 效應(yīng)的能力，可以靶向殺傷功能蛋白受體陽性細胞。在抗體應(yīng)用領(lǐng)域，尤其是具有抗腫瘤活性的抗體，通過優(yōu)化 Fc 段氨基酸組成或糖基化模式等，從而加強由其介導(dǎo)的 ADCC、CDC 等細胞毒活性的研究已經(jīng)成為一個熱點。

非溶細胞性融合蛋白由功能性蛋白與活性降低的Fc 片段融合，通過對 Fc 片段上補體受體結(jié)合域或糖基化模式的突變改造，調(diào)節(jié) Fc 與相關(guān)受體的結(jié)合親和力，降低或消除 ADCC 和 CDC 效應(yīng)，只保留功能蛋白的生物學(xué)活性和 Fc 段長效體內(nèi)半衰期，而不產(chǎn)生細胞毒性。例如，研究者利用 IgD 和 IgG4 組成的雜合 Fc（hybrid Fc，hyFc）與促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO融合，構(gòu)建不能結(jié)合 FcγR I 和 C1q，無細胞毒性的長效 EPO-hyFc 分子，其半衰期達到了重組人 EPO——阿法達貝泊汀（darbepoetin alfa）的 2 倍。Vafa 等通過氨基酸替換，微調(diào)蛋白三級結(jié)構(gòu)，破壞結(jié)合 FcγR和補體的活性，構(gòu)建能夠完全消除免疫效應(yīng)功能，但能夠正常結(jié)合新生兒 Fc 受體（neonatal Fc receptor， FcRn），保持比 IgG2 更長循環(huán)血漿半衰期的 IgG2-Fc 突變體。Hristodorov 等通過比較 6 種去糖基化的hIgG 單抗和它們的糖基化物的理化性質(zhì)和抗原結(jié)合力等，發(fā)現(xiàn)去糖基化的 IgG1 單抗具有與糖基化物相似的功能，并且由于前者引發(fā)免疫效應(yīng)的能力降低，從而更適用于作為治療慢性疾病藥物的融合伴侶。

2 Fc 融合蛋白理化性質(zhì)和生物學(xué)活性的影響因素

Fc 融合蛋白的 2 個組成部分，通常具有相對獨立的結(jié)構(gòu)域和功能，能夠從不同的角度影響該類分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性。

2.1 Fc 結(jié)構(gòu)域

Fc 融合蛋白的重要特點是包含 Fc 片段，同時，這也是影響其理化性質(zhì)和生物學(xué)活性的關(guān)鍵因素。

抗體類藥物往往具有較長的血漿半衰期，人體內(nèi)源性免疫球蛋白在 FcRn 的保護下，血漿半衰期能達到 19 d。Fc 融合蛋白含有的 Fc 片段也能夠通過類似的原理延長其半衰期，即 Fc 片段通過 CH2-CH3 與 FcRn 結(jié)合并呈 pH 依賴性：在 pH 7.4 的生理條件下，F(xiàn)cRn 與Fc 不結(jié)合；在細胞內(nèi)涵體 pH 6.0~6.5 的酸性條件下，兩者結(jié)合，從而避免融合分子在細胞內(nèi)被溶酶體等快速降解。同時，融合 Fc 片段能夠增大分子體積，降低腎清除率。當(dāng)然，還可以通過基因工程手段對 Fc 段的氨基酸序列進行突變，獲得半衰期更長的突變型融合蛋白。如阿斯利康的 Motavizumab-YTE 突變體的 Fc 段包含了 3 個突變：“YTE”，即 252、254 和 256 位的蛋氨酸（Met，M）、絲氨酸（Ser，S）和蘇氨酸（Thr，T）分別被酪氨酸（Tyr，Y）、T 和谷氨酸（Glu，E）替換，Ⅰ期臨床研究證實本品在健康人體內(nèi)的血漿半衰期達到100 d，約為 Motavizumab 原型的 2~4 倍，而清除率僅為原型的 71%~86%?！癥TE”這一突變技術(shù)將有望應(yīng)用于其他抗體的優(yōu)化，從而提高半衰期，減少給藥頻率。

除了長效性，F(xiàn)c 片段還能提高分子的穩(wěn)定性。Fc融合蛋白可以通過 Fc 鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接形成穩(wěn)定的二聚體，進一步通過對二硫鍵的基因工程改造和修飾，還可以使 Fc 融合蛋白聚集成六聚體復(fù)合物。Fc 區(qū)域可以獨立折疊，保證伴侶分子體內(nèi)外的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，與 Fc 進行融合能夠提高蛋白在哺乳動物細胞內(nèi)的表達，另一方面 Fc 片段可以與 Protein A 親和柱特異性結(jié)合，簡化 Fc 融合蛋白的純化步驟，這在相關(guān)生物制品的研發(fā)過程中具有重要的意義。

不同 Fc 片段能夠特異性地結(jié)合體內(nèi)相關(guān) Fc 受體（FcR），并發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能（見表 1），F(xiàn)c片段結(jié)合 FcR 發(fā)揮的生物學(xué)功能主要有以下 3 類。

1）結(jié)合免疫細胞表面的激活性或抑制性受體，正向或負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。激活性受體（如 FcγR Ⅱ A等）的胞漿區(qū)含有免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-based activation motifs，ITAM），而抑制性受體（如FcγRⅡB等）胞漿區(qū)則含有抑制性基序（immunoreceptor tyrosine-basedinhibitory motifs，ITIM），分別起到活化和抑制免疫效應(yīng)的作用。

2）作為免疫復(fù)合物一部分，協(xié)助免疫細胞攝取抗原。如 FcγR 介導(dǎo)的抗原攝取能夠加強樹突狀細胞遞呈抗原和激活 CD4+ 和CD8+ T 細胞的能力。

3）參與免疫球蛋白的運輸，如 IgG 與 FcRn 的結(jié)合。

2.2 功能蛋白

雖然對 Fc 片段的改造會影響 Fc 融合蛋白的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性，但其藥理活性還是主要取決于功能蛋白部分。功能蛋白應(yīng)能特異性地結(jié)合某個靶點分子。例如，能夠結(jié)合腫瘤壞死因子（TNF）并拮抗其作用的上市藥物有：TNF 全長抗體（如 infliximab、adalimumab 和golimumab），PEG 修飾的Fab（如 certolizumab pegol）和TNFR-Fc融合蛋白（如etanercept）。靶點為VEGF的藥物有：VEGF人源化抗體（如 bevacizumab），衍生自bevacizumab的Fab（如 ranibizumab）和VEGFR-Fc融合蛋白（如 aflibercept）。此外，人抗白介素-1β單克隆抗體（如canakinumab）、重組IL-1R（如anakinra）和 IL-1R/Fc 融合蛋白（如 rinolacept）均能與 IL-1 相結(jié)合。

對功能蛋白性質(zhì)的優(yōu)化，也將對整個融合分子產(chǎn)生積極影響。胰高血糖素樣肽 -1（GLP-1）可通過多種機制明顯改善 2 型糖尿病患者血糖情況，但是內(nèi)源性 GLP-1 極易被體內(nèi)的二肽基肽酶 - Ⅳ（DPP-IV）降解，血漿半衰期不足 2 min，必須持續(xù)靜脈滴注或皮下注射才能產(chǎn)生療效，大大限制了其臨床應(yīng)用。禮來公司新研發(fā)的 GLP-1/Fc 融合蛋白——dulaglutide，通過融合 hIgG4-Fc 達到降低免疫原性、減少腎清除率和延長半衰期的目的，同時還將 GLP-1 改造為耐受 DPP-IV 的 GLP-1 酰胺類似物，在保證活性的前提下，進一步提高了分子的穩(wěn)定性。

3 Fc 融合蛋白類藥物

1989 年，Capon 等首次在《自然》（Nature ）上報了一種能夠結(jié)合 HIV 囊膜蛋白 gp120，阻礙 HIV-1 感染 T細胞和單核細胞的 CD4-Fc 融合蛋白，此后，基于抗體Fc 段的 Fc 融合蛋白的研究和開發(fā)在世界范圍內(nèi)得到了迅速的發(fā)展。

3.1 已上市藥物

2012 年，阿達木單抗（通用名：adalimumab，商品名：Humira）、英夫利昔單抗（通用名：infliximab，商品名：Remicade）和依那西普（通用名：etanercept，商品名：Enbrel）這 3 種治療自身免疫性疾病的抗體類藥物分別以 92.65、82.15 和 79.63 億美元的全球銷售額榮登當(dāng)年最暢銷藥品榜單前三甲。作為最成功的 Fc 融合蛋白藥物， Enbrel 在 2013 年的全球銷售額也達到了 46.81 億美元，超過了除 Humira 之外的其他單抗類藥物。

目前，由 FDA 批準(zhǔn)上市的 Fc 融合蛋白類藥物主要有7 種（見表 2），均由重組內(nèi)源性多肽或其突變體與 Fc 片段融合而成，大多數(shù)涉及自身免疫性疾病的治療；在表達方式上，除了 romiplostim 由大腸桿菌進行原核表達，其余均由哺乳動物細胞表達。由于原核表達缺少真核轉(zhuǎn)錄后的蛋白修飾過程，酵母、昆蟲和植物細胞表達系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄后加工修飾體系與哺乳動物細胞不完全相同，且表達的蛋白在糖鏈的結(jié)構(gòu)和組分上與哺乳動物表達系統(tǒng)表達的蛋白有所差異。鑒于糖基化作用對于抗體類藥物的重要意義，為了獲得蛋白折疊、理化性質(zhì)和生物學(xué)活性等方面更接近于天然狀態(tài)的的蛋白分子，利用哺乳動物細胞表達 Fc 融合蛋白已經(jīng)成為一種趨勢。

3.2 臨床在研藥物

除了已經(jīng)上市的 Fc 融合蛋白類藥物，目前還有很多在研藥物已經(jīng)進入了Ⅱ期和Ⅲ期臨床研究階段（見表 3）。

Amgen 公司的 trebananib 能夠通過結(jié)合血管緊張素 1和 2，抑制兩者與 Tie2 受體的結(jié)合，從而抑制因血管增生導(dǎo)致的腫瘤惡化，該藥物目前正在進行Ⅲ期臨床試驗，包括 TRINOVA-1、TRINOVA-2、TRINOVA-3 共 3 個部分，其中第一部分的研究結(jié)果已于 2013年6月在Amgen 公司官網(wǎng)上發(fā)布。

Biogen Idec 公司開發(fā)了用于治療乙型血友病的Ⅸ因子 -Fc 融合蛋白和用于治療甲型血友病的Ⅷ因子 -Fc 融合蛋白，其Ⅲ期臨床研究結(jié)果顯示，F(xiàn)c 融合重組蛋白的血漿半衰期均比原型分子長，且對血友病患者急性出血有良好的預(yù)防作用。

2013年6月，美國糖尿病協(xié)會（ADA）芝加哥會議上，禮來公司公布了其開發(fā)的治療 2 型糖尿病的新藥dulaglutide 的Ⅲ期臨床研究數(shù)據(jù)。該藥由 GLP-1 類似物和 hIgG4-Fc 融合而成，是一種長效 GLP-1 受體激動劑，具有每周給藥 1 次和耐受性良好的優(yōu)點。3 項分別名為AWARD-1、AWARD-3、AWARD-5 的研究數(shù)據(jù)顯示，與二甲雙胍、艾塞那肽注射液（商品名：Byetta）和磷酸西格列?。ㄉ唐访篔anuvia）相比，dulaglutide 有良好的降低血糖和控制體質(zhì)量的效果。禮來已于 2013年10月向FDA 和 EMA 提交了新藥上市許可申請，若能獲得批準(zhǔn)， dulaglutide 將與同樣是每周注射1次的糖尿病藥物——艾塞那肽緩釋注射用混懸劑（商品名：Bydureon），以及每天1次的 Victoza、2 天 1 次的 Byetta 等藥物角逐抗糖尿病藥物市場。不少糖尿病患者往往需要 2 種或以上藥物才能有效控制血糖，因此，只需要每周給藥 1 次的注射劑具有很大的應(yīng)用潛力。同時，禮來也在研發(fā)便捷且病人用藥依從性較好的相關(guān)給藥設(shè)備。

4 Fc 融合蛋白在疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用

疫苗設(shè)計的關(guān)鍵在于有效活化抗原遞呈細胞（antigen presenting cell，APC），促進抗原遞呈和激活免疫反應(yīng)樹突狀細胞（dendritic cells，DC）是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強大的抗原遞呈細胞。采自病人的單核細胞可以先經(jīng)體外誘導(dǎo)生成 DC，再通過抗原肽刺激、抗原基因轉(zhuǎn)染、腫瘤提取物刺激以及與腫瘤細胞融合等方法負(fù)載相應(yīng)的抗原，從而制備能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)殺傷性 T 細胞，激發(fā)免疫反應(yīng)的DC 疫苗，發(fā)揮長效的抗腫瘤、抗病毒作用。由于 APC 表面能夠表達 FcR，所以抗原 -Fc 融合蛋白能夠作為抗原運載工具，借助 Fc 片段靶向結(jié)合 APC，縮短抗原在血漿中的游離時間，減少蛋白酶對抗原的降解，提高抗原半衰期，從而加強抗原的遞呈。其中，轉(zhuǎn)染抗原 -Fc 基因的DC 細胞，不僅能夠持續(xù)表達抗原 -Fc 融合分子，產(chǎn)生較長效的免疫激活，還可以克服其他體外抗原刺激方法不可避免的問題，如抗原 MHC 復(fù)合物解離或細胞 MHC 分子降解。由于細胞內(nèi)能夠結(jié)合 Fc 并影響免疫反應(yīng)的受體蛋白如 FcRL（Fc receptor-like）和 TRIM21 （tripartite motif-containing protein21）等不斷被發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)c 融合蛋白類疫苗能結(jié)合的受體不僅僅局限于 APC 表面的 FcR，應(yīng)用前景也將大大擴展。

4.1 Fc 骨架的選擇

目前用于疫苗研究的 Fc 融合蛋白大多數(shù)都以 IgG-Fc為骨架，Loureiro 等利用昆蟲細胞表達了血凝素 /hIgG-Fc 融合蛋白，并證明了其在動物體內(nèi)的免疫原性，為流感疫苗的研究提供了一種候選方案。Du 等將 H5N1 血凝素和 hIgG-Fc 融合構(gòu)建重組疫苗，并證實該分子能夠誘發(fā)已免疫小鼠產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)。以 HIV 為治療目標(biāo)的多數(shù)在研疫苗也是基于最常見的 IgG-Fc 骨架，如 p24-mIgG1/mIgG2a、p24-mIgG2a、gp41-hIgG1等。但是，在某些特殊情況下，利用其他類別的免疫球蛋白作為融合骨架，可能會取得更好的治療效果。比如，IgA 是黏膜免疫中最為重要的抗體分子，能夠通過形成免疫復(fù)合物，誘導(dǎo)強效的促炎反應(yīng)保護黏膜免受病原體的傷害，因此研究黏膜免疫疫苗時，將抗原與 IgA-Fc 融合比與 IgG-Fc 更適合。FcRL4 主要在上皮和黏膜淋巴組織邊緣區(qū)的記憶 B 細胞上表達，是目前唯一已知的 IgA 的抑制性受體。有研究表明，下調(diào) HIV 感染病人體內(nèi)記憶 B 細胞的 FcRL4 等抑制性受體，能夠促進 B 細胞的增殖，并提高 HIV 特異性抗體分泌細胞、B 細胞相關(guān)趨化因子和細胞因子的水平。因此，可以設(shè)計基于 IgA-Fc 骨架的 Fc 融合蛋白，封閉FcRL4 的作用，從而提高機體對 HIV 或其他慢性病毒感染的反應(yīng)力。

4.2 效價的提高

為了提高 Fc 融合蛋白結(jié)合 APC 上低親和力受體的能力，Mekhaiel 等構(gòu)建了一種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、效價提高的包含 12 個融合抗原的 Fc 融合蛋白六聚體，并通過原子力顯微鏡展示了其柱狀空間結(jié)構(gòu)。沒有融合抗原時，六聚體能選擇性結(jié)合 FcγR，且親和力大大超過了單體形式。融合抗原后，為了降低抗原與 Fc 片段空間結(jié)構(gòu)的相互影響，可以選擇鉸鏈區(qū)較長的 IgG3 作為高效價多聚 Fc 融合蛋白的骨架。

4.3 抗原的選擇

為了保證 Fc 融合蛋白類疫苗的有效性，應(yīng)融合能夠被 APC 上的固有受體識別的抗原，比如病毒表面糖蛋白抗原或腫瘤相關(guān)抗原等。Hong 等為了將 HBsAg 與mIgG2a-Fc 融合，構(gòu)建了 Lentivector HBS-Fc-lv 重組質(zhì)粒，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293 細胞后，HBsAg 上清表達量為對照組（即轉(zhuǎn)染了 Lentivector HBS-lv 質(zhì)粒的 293 細胞）的 10 倍；以Lentivector- HBS-Fc-lv 免疫正常小鼠，能誘發(fā) HBsAg 特異性被動免疫反應(yīng)；而免疫 HBsAg 轉(zhuǎn)基因鼠（血清中存在低水平 HBsAg，為 HBV 慢性感染模型鼠）則能破壞其免疫耐受，增強 HBsAg 特異性免疫反應(yīng)，更重要的是實現(xiàn)了特異性抗體的血清轉(zhuǎn)換，從而為抗病毒藥物，尤其是慢性 HBV 感染治療提供了新思路。誘發(fā)抗瘤免疫反應(yīng)的一個重要挑戰(zhàn)是實現(xiàn) DC 細胞對原始或修飾后腫瘤抗原的有效攝取和加工，從而激活免疫效應(yīng)細胞和限制調(diào)節(jié)性 T細胞的活性。Gil 等以雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂 GD2 的模擬肽 47-LDA 為抗原分子，設(shè)計了 47-LDA-Fcγ2a-DC 疫苗，該疫苗能夠激活和擴增腫瘤特異性 CD⁸⁺ 細胞，抑制原發(fā)性腫瘤生長，誘發(fā)比 47-LDA-DC 疫苗更高水平的免疫反應(yīng)和保護作用，且抗癌效果與表達 47-LDA-Fcγ2a 融合蛋白的重組溶瘤痘苗病毒疫苗的效果相當(dāng)。

5 Fc 融合蛋白的非臨床應(yīng)用

可溶性Fc融合蛋白不僅在免疫治療領(lǐng)域有重要應(yīng)用，且隨著研究的深入，還可以應(yīng)用于流式細胞、免疫組化、體外活性檢測和蛋白微陣列檢測等非臨床領(lǐng)域。功能分子（如酶、抗原、受體、配體、細胞因子等）融合 Fc后不僅能提高穩(wěn)定性，而且可以通過 Fc 與 proteinA/G 的結(jié)合作用，將 Fc 融合蛋白綁定在連有 proteinA/G 的固相載體上，構(gòu)建蛋白微陣列或微球，從而捕獲復(fù)雜組分（如血液、組織液、細胞裂解液、淋巴液等）中能與之特異性結(jié)合的待測蛋白，以探索蛋白之間的相互作用。Ramani等將細胞分泌蛋白 -Fc 融合分子與 proteinA 微球結(jié)合形成多價復(fù)合物，構(gòu)建蛋白微陣列，篩選能與其相互作用的分子。

治療性抗體及其類似物的相關(guān)研究表明，以體內(nèi)蛋白（如受體或細胞因子等）為直接靶點的藥物可以有多種設(shè)計思路，包括直接拮抗其作用的特異性抗體、Fab 片段和受體 -Fc 融合蛋白等。隨著生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、計算生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，通過分析已有的配體 / 受體結(jié)構(gòu)信息和相互作用模型等，可以設(shè)計能與相應(yīng)受體（或配體）結(jié)合的配體（或受體）-Fc 融合蛋白，其一方面保留了功能蛋白的活性，另一方面具有抗體 Fc 片段的多種性質(zhì)，并可通過調(diào)整 Fc 的活性和功能，滿足實際應(yīng)用需要。Fc融合蛋白作為抗體應(yīng)用的一個衍生領(lǐng)域，憑借其獨特的結(jié)構(gòu)和活性特點，在臨床和非臨床領(lǐng)域都將有著廣泛的應(yīng)用前景。

參考文獻

PROGRESSIN PHARMACEUTICAL SCIENCES