作者：王巧芳

摘要

目的：應(yīng)用胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)輔助趨化因子通路，促進(jìn)骨髓中髓細(xì)胞募集，建立免疫抑制腫瘤微環(huán)境(TME)。單獨(dú)靶向腫瘤相關(guān)的CXCR2+中性粒細(xì)胞(TAN)或CCR2+巨噬細(xì)胞(TAM)提高臨床前模型的抗腫瘤免疫。然而，替代骨髓亞群的代償性內(nèi)流可能導(dǎo)致持久的免疫抑制TME并促進(jìn)治療耐藥性。在這里，作者展示了CCR2和CXCR2聯(lián)合阻滯劑可減少浸潤腫瘤的骨髓樣細(xì)胞的總量，促進(jìn)了PDAC中抗腫瘤免疫反應(yīng)的增強(qiáng)。

方法：對PDAC患者和對照組的外周血、骨髓和腫瘤進(jìn)行分析。治療反應(yīng)和相關(guān)研究分別在小鼠原位PDAC腫瘤中使用小分子CCR2抑制劑(CCR2i)和CXCR2抑制劑(CXCR2i)單獨(dú)和聯(lián)合化療。

結(jié)果：全身CXCR2+ TAN增加與PDAC預(yù)后不良相關(guān)，CCR2i患者治療后腫瘤浸潤C(jī)XCR2+ TAN增加。在原位PDAC模型中，CXCR2阻斷阻止了中性粒細(xì)胞的流動(dòng)和增強(qiáng)化療療效。然而，CXCR2+ TAN或CCR2+ TAM的缺失導(dǎo)致了替代骨髓亞群的代償性反應(yīng)，再現(xiàn)了人類疾病。通過聯(lián)合使用CCR2i和CXCR2i，可以增強(qiáng)抗腫瘤免疫和改善對FOLFIRINOX化療的反應(yīng)。

結(jié)論：CCR2+ TAM和CXCR2+ TAN雙靶向治療可提高PDAC的抗腫瘤免疫和化療反應(yīng)。

背景
胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第四大主要原因，預(yù)計(jì)在未來十年發(fā)病率將會(huì)上升。盡管在PDAC中使用常規(guī)化療取得了進(jìn)展，5年生存率仍然是令人沮喪的8%，免疫抑制腫瘤微環(huán)境(TME)仍然是有效治療的重要障礙。纖維化間質(zhì)室被腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)和腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(TAN)浸潤，這些細(xì)胞從骨髓中招募而來，以促進(jìn)PDAC免疫逃避。因此，阻斷髓系運(yùn)輸?shù)闹委熓腔謴?fù)抗腫瘤免疫的一種有吸引力的方式。

中性粒細(xì)胞是最豐富的骨髓人群，有報(bào)道稱在癌癥中出現(xiàn)全身性粒細(xì)胞增加，與不良預(yù)后相關(guān)的是腫瘤內(nèi)積聚的TAN (CD11b+、CD14、CD15+和CD66b+)。ELR+趨化因子家族中的CXCR2及其配體，包括CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL7和CXCL8，負(fù)責(zé)在正常生理?xiàng)l件下招募中性粒細(xì)胞，并參與腫瘤介導(dǎo)的TAN動(dòng)員。攜帶腫瘤的動(dòng)物也顯示出全身性的TAN增加(CD11b+， Gr1High, Ly6CLow和LY6GHigh)，并且在臨床前研究中，靶向TAN可以增加腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)并改善對檢測點(diǎn)阻斷的反應(yīng)。

作者先前的研究發(fā)現(xiàn)PDAC表達(dá)CCL2動(dòng)員CCR2 +炎癥巨噬細(xì)胞從骨髓腫遷移到腫瘤。然而，他們成為免疫抑制TAM。在多種惡性腫瘤中，密集的TAM(CD11b + CD115 +,CD14 + CD15和CD68 +)浸潤與降低的生存率相關(guān)，且在小鼠腫瘤模型中，靶向CCR2 + TAM(CD11b + Gr1Low、LY6Glow Ly6CMid和F4/80High)治療可減緩腫瘤進(jìn)展。基于這些發(fā)現(xiàn)，作者使用口服小分子CCR2抑制劑(CCR2i) PF-04136309聯(lián)合FOLFIRINOX對非轉(zhuǎn)移性PDAC患者進(jìn)行了臨床試驗(yàn)(NCT01413022) ，與單純化療比較臨床反應(yīng)較好。

然而，腫瘤介導(dǎo)的骨髓來源細(xì)胞的招募是一個(gè)復(fù)雜的過程，而免疫調(diào)節(jié)療法的破壞并非沒有補(bǔ)償性反應(yīng)。一些研究發(fā)現(xiàn)，耗盡TAM導(dǎo)致了一種代償性的TAN流入，這可能導(dǎo)致CCR2阻斷后的治療失敗。因此，目前尚不清楚是否擾亂單個(gè)骨髓亞群是靶向免疫抑制TME的最有效方法。

在這里，作者報(bào)道了靶向CCR2+ TAM治療的結(jié)果是PDAC患者的中性粒細(xì)胞補(bǔ)償性流入，提供了第一個(gè)報(bào)告的證據(jù)，免疫調(diào)節(jié)療法可能導(dǎo)致原發(fā)性腫瘤的動(dòng)態(tài)髓樣反應(yīng)，可能限制預(yù)期的治療效果。這種現(xiàn)象在有腫瘤的動(dòng)物身上得到了再現(xiàn)，CXCR2+ TAN和CCR2+ TAM的協(xié)同靶向抑制了髓細(xì)胞的代償性流入，同時(shí)有證據(jù)表明抗腫瘤免疫反應(yīng)更強(qiáng)。這些數(shù)據(jù)建立在以人類癌癥中骨髓來源細(xì)胞為靶點(diǎn)的新療法的基礎(chǔ)上，并表明以TAM和TAN為靶點(diǎn)可能是最佳的治療組合。

本研究的主要內(nèi)容

臨床實(shí)驗(yàn)
1. PDAC患者外周血和骨髓中CXCR2+中性粒細(xì)胞全身性升高與總體生存期有關(guān)
2. 評估人PDAC中ELR+趨化因子表達(dá)升高與CXCR2+TAN和預(yù)后不良的相關(guān)性
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
3. 在攜帶PDAC腫瘤的動(dòng)物中，靶向CXCR2可以阻斷外周血的中性粒細(xì)胞和阻斷TAN募集 
4. 人類和小鼠的PDAC腫瘤顯示骨髓細(xì)胞靶向治療后發(fā)生了髓樣替代，這可通過CCR2和CXCR2聯(lián)合阻斷來克服。
5. 聯(lián)合減少PDAC浸潤的CCR2+巨噬細(xì)胞和CXCR2+中性粒細(xì)胞，可以改善抗腫瘤T細(xì)胞的反應(yīng)

內(nèi)容1、PDAC患者外周血和骨髓中CXCR2+中性粒細(xì)胞全身性升高與總體生存期降低

首先作者用標(biāo)準(zhǔn)ROC曲線分析術(shù)前NLR（中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值）與術(shù)后患者生存率關(guān)系，最佳NLR截止時(shí)間為2.1，患者(n=439)分為高(>2.1)和低(2.1)兩組?？傮w而言，PDAC患者切除后，高NLR (n=286)患者預(yù)后較差，5年生存率為17.3%，而低NLR組(n=153)生存率為26.5%。NLR高的患者中位生存期為18個(gè)月，而NLR低的患者中位生存期為23個(gè)月(HR=0.74 (95% CI 0.58 ~ 0.93))。

其次通過流式分析顯示PDAC患者，外周血和骨髓中表達(dá)CXCR2的中性粒細(xì)胞均升高

然后通過與健康對照組相比，表明PDAC患者外周血中CXCR2+中性粒細(xì)胞明顯增加，存活不足1年的患者外周血CXCR2+中性粒細(xì)胞較多，與生存率成反比。(P=0.019; Pearson’s = 0.66 (95% CI 0.90 - 0.14))

同樣的，與對照組相比，PDAC患者骨髓中CXCR2+中性粒細(xì)胞增加。與外周血相似，這種增加與1年生存率降低有關(guān)，骨髓CXCR2+中性粒細(xì)胞百分比與生存率成反比
這說明PDAC導(dǎo)致外周血和骨髓中CXCR2+中性粒細(xì)胞全身性升高，與較差的臨床預(yù)后相關(guān)。

內(nèi)容2：評估人PDAC中ELR+趨化因子表達(dá)升高與CXCR2+TAN和預(yù)后不良的相關(guān)性

補(bǔ)充一下：趨化因子  CC和CXC是趨化因子其中的兩個(gè)亞家族，CCR和CXCR是趨化因子的受體，CCL和CXCL是其對應(yīng)的配體（即趨化因子）。CXC亞家族根據(jù)其第一個(gè)半胱氨酸前是否有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸（Glu-Leu-Aeg)序列進(jìn)一步分為ELR+和ELR-兩類。前者有促進(jìn)血管新生的作用。

首先表明趨化因子表達(dá)增加
作者采用QRT-PCR發(fā)現(xiàn)相對于正常人胰腺，PDAC患者腫瘤中ELR+趨化因子的表達(dá)增加與腫瘤浸潤C(jī)XCR2+ TAN的增多程度相關(guān)，這與之前的報(bào)道一致，GM-CSF和G-CSF過表達(dá)，而M-CSF未見過表達(dá)。
作者又采用QRT-PCR對PDAC患者腫瘤組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ELR+趨化因子CXCL1、CXCL2、CXCL5和CXCL8表達(dá)增加，且可見CXCL5倍增最多。

其次表明趨化因子來源于腫瘤導(dǎo)管細(xì)胞
對PDAC患者腫瘤組織進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)腫瘤導(dǎo)管細(xì)胞是CXCL1、CXCL2、CXCL5和CXCL8的主要來源，而不是基質(zhì)細(xì)胞。

然后表明CXCL5與CXCR2+TAN的相關(guān)性
作者特別關(guān)注CXCL5，因?yàn)樗贓LR+趨化因子中表現(xiàn)出最大倍數(shù)增加，并發(fā)現(xiàn)CXCL5的表達(dá)與腫瘤浸潤C(jī)D15+粒細(xì)胞(Pearson rho=0.837 (95% CI 0.73 - 0.90)呈正相關(guān);圖2D)和中性粒細(xì)胞彈性酶陽性(NE+)粒細(xì)胞(Pearson rho=0.635 (95% CI 0.43 - 0.70);圖2 e)正相關(guān)。
總之，這表明PDAC表達(dá)的ELR+趨化因子，特別是CXCL5，可能對促進(jìn)CXCR2+中性粒細(xì)胞的募集很重要。

再然后，表明腫瘤組織高表達(dá)CXCR2+TAN
作者通過免熒光顯示PDAC腫瘤被CXCR2+ TAN嚴(yán)重浸潤，通過流式細(xì)胞分析正常胰腺組織和腫瘤組織，顯示腫瘤組織中CXCR2+TAN增多。PDAC被CXCR2+ TAN嚴(yán)重浸潤，在人類疾病中具有預(yù)后意義。 

最后：表明ELR+趨化因子與預(yù)后的相關(guān)性
與NLR在外周血預(yù)后的發(fā)現(xiàn)類似，作者發(fā)現(xiàn)低、中、高CD15+ TAN + 與CD8+淋巴細(xì)胞比率在PDAC腫瘤中，中位生存率分別為2,1.5和1年(圖2G)。與兩組相比，高比率與整體存活率更低有關(guān)。此外，與其中任何一組相比，NE 與 CD8比值高的PDAC患者生存率降低與作者發(fā)現(xiàn)CXCL5表達(dá)與TAN浸潤相關(guān)一致，CXCL5與CD8+比值升高也與預(yù)后較差相關(guān)，中位生存期為0.65年，與1.3年或1.8年相比分別在中、低兩組觀察到(圖2I)。綜上所述，提示CXCR2+ TAN是一種優(yōu)勢免疫浸潤物，在PDAC中具有臨床意義。

然后作者進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和靶向治療

內(nèi)容3：在攜帶PDAC腫瘤的動(dòng)物中，靶向CXCR2可以阻斷外周血的中性粒細(xì)胞和阻斷TAN募集

首先構(gòu)建動(dòng)物模型
作者用鼠PDAC細(xì)胞系KCKO構(gòu)建鼠原位PDAC腫瘤模型，采用QRT-PCR分析腫瘤組織中趨化因子表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)胰腺癌相對于正常胰腺表達(dá)GM-CSF、G-CSF和CXCR2的配體CXCL1、CXCL2和CXCL5增加。與人PDAC結(jié)果一致。

其次發(fā)現(xiàn)CXCR2+TAN升高
作者在上述構(gòu)建的小鼠模型中通過對組織的流式分析發(fā)現(xiàn)，外周血和骨髓中CXCR2+中性粒細(xì)胞呈均升高，且這種升高不能被CXCR2i抑制，甚至在外周血中還具有促進(jìn)作用。

然后發(fā)現(xiàn)CXCR2i可以抑制LY6G+細(xì)胞浸潤
在上述動(dòng)物模型腫瘤組織中,采用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性腫瘤的特征是大量的多核LY6G+細(xì)胞浸潤，且這種浸潤可以被CXCR2i抑制.

再然后 CXCR2i靶向治療對腫瘤體積的影響
用CXCR2i對上述構(gòu)建的鼠模型進(jìn)行靶向治療，發(fā)現(xiàn)靶向治療可顯著降低皮下KCKO腫瘤進(jìn)展。

為了證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，作者檢測了來自KPC基因工程模型的另一個(gè)同源PDAC細(xì)胞系的原位腫瘤(p48CRE/LSL-KrasG12D/p53flox/flox)，發(fā)現(xiàn)CXCR2i也阻止了模型中TAN的積累(在線補(bǔ)充圖S3)

最后表明CXCR2i或LY6G耗竭對腫瘤重量的作用
在建立的KPC疾病模型中， 作者用CXCR2i或LY6G特異性耗盡抗體治療，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，腫瘤重量減輕。綜上所述，這表明CXCR2的阻斷可以防止中性粒細(xì)胞從外周血中運(yùn)輸，減少TAN，其治療效果與全身性耗竭相似

內(nèi)容4：人類和小鼠的PDAC腫瘤顯示骨髓細(xì)胞靶向治療后發(fā)生了髓樣替代，這可通過CCR2和CXCR2聯(lián)合阻斷來克服。

有研究已經(jīng)在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)CCR2+中性粒細(xì)胞替代亞群，對PDAC邊緣可切除局部高級(jí)別的患者進(jìn)行靶向CCR2治療臨床實(shí)驗(yàn)，顯示出可喜的結(jié)果。

因此，作者通過CCR2i阻斷治療4周后，對腫瘤組織活檢，流式分析，發(fā)現(xiàn)靶向治療后，腫瘤組織中CXCR2+TAN較基線水平升高。

然后表明骨髓靶向治療的髓樣替代作用
作者在荷瘤的CCR2-/-鼠和荷瘤的CCR2i處理的野生鼠中，25天后對腫瘤組織行流式發(fā)現(xiàn)CXCR2+TAM代償性替代，這一現(xiàn)象也發(fā)生在聯(lián)合FOLFIRINOX化療中（圖B,C）。單獨(dú)靶向CCR治療，TAM升高；單獨(dú)靶向TAM治療，TAN升高；兩者同時(shí)抑制，TAN和TAM均降低，且在聯(lián)合FOLFIRINOX化療中效果一致（圖C,D）。

這一現(xiàn)象的一種可能解釋是觀察到與TAM的產(chǎn)生和招募相關(guān)的因素，即CSF1和CCL2，在阻斷CXCR2+ TAN后有所增加。同樣，CCR2i導(dǎo)致CXCL1、CXCL2、CXLC5和G-CSF表達(dá)增加(在線補(bǔ)充圖S4)。

隨之作者通過流式分析評估總腫瘤浸潤骨髓情況

發(fā)現(xiàn)聯(lián)合CCR2i + CXCR2i抑制治療，或者單獨(dú)CCR2i或者 CXCR2i 聯(lián)合FOLFIRINOX治療，都能防止這種代償作用并減少腫瘤浸潤骨髓細(xì)胞。

然后作者在構(gòu)建的荷瘤鼠模型中，分別進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)

發(fā)現(xiàn)CCR2 + CXCR2聯(lián)合阻滯劑可提高腫瘤小鼠的化療療效并提高生存率，而CCR2i和CXCR2i作為單一藥物有效降低了既定的原位腫瘤重量和體積。即使用雙CCR2 + CXCR2阻滯劑可顯著降低KCKO腫瘤，聯(lián)合FOLFIRINOX化療方案可以增加腫瘤對化療的敏感性。

最后表明FOLFIRINOX聯(lián)合髓樣抑制對生存期的影響

當(dāng)髓樣阻滯與FOLFIRINOX聯(lián)合使用時(shí)，腫瘤負(fù)擔(dān)的減輕會(huì)增強(qiáng)。
FOLFIRINOX聯(lián)合CCR2i或CXCR2i進(jìn)一步提高了KPC基因工程模型的原位腫瘤小鼠的存活率(圖4G)。

此外，與任何一種聯(lián)合相比，F(xiàn)OLFIRINOX雙重CCR2 + CXCR2阻斷對提高生存率最多。

總的來說，這表明，與單獨(dú)使用的兩種策略相比，同時(shí)使用CCR2和CXCR2靶向骨髓細(xì)胞募集可以提高化療反應(yīng)敏感性。

內(nèi)容5：聯(lián)合減少PDAC浸潤的CCR2+巨噬細(xì)胞和CXCR2+中性粒細(xì)胞，可以改善抗腫瘤T細(xì)胞的反應(yīng)

首先作者在構(gòu)建的腫瘤小鼠模型中說明靶向治療對CD8+和CD4+ TIL的影響

通過靶向抑制CCR2或者CXCR2 25天后，對腫瘤組織行流式分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤髓樣的減少卻增加了小鼠的效應(yīng)T細(xì)胞的量，聯(lián)合抑制與單獨(dú)抑制相比CD8+和CD4+ TIL的流入明顯更大，當(dāng)與FOLFIRINOX聯(lián)合測試時(shí)也發(fā)現(xiàn)了這一點(diǎn)(圖5A,B)。
我覺得B圖縱軸應(yīng)該是CD4+？，可能是標(biāo)記錯(cuò)誤。

然后表明靶向治療后對CD4+亞群的影響

在原為移植腫瘤小鼠中，治療25天后，流式分析，腫瘤組織中CD4+TIL細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，表明CCR2i或CXCR2i單獨(dú)抑制時(shí)CD4+TIL細(xì)胞百分比明顯減低，聯(lián)合抑制時(shí)，沒有更進(jìn)一步的變化，在聯(lián)合FOLFIRINOX治療時(shí)出現(xiàn)一致的結(jié)果。

接下來,作者評估IFNγ+CD8 +TIL及激活狀態(tài)的C8+細(xì)胞在靶向治療后變化
荷瘤小鼠不同靶向處理25天后，腫瘤組織流式分析顯示增加細(xì)胞內(nèi)IFNγ，CD8 +TIL細(xì)胞表面表達(dá)的CD44 + 、CD69 +、CD62L標(biāo)記物增加 。且聯(lián)合靶向治療后增加更多，尤其是激活狀態(tài)的CD8+TIL細(xì)胞。

然后為了證實(shí)這種激活狀態(tài)CD8+TIL的增加忠實(shí)地反映了T細(xì)胞受體(TCR)對抗原的識(shí)別，作者接下來檢測了Nur77GFP小鼠從PDAC腫瘤中提取的CD8+淋巴細(xì)胞中綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，該表達(dá)在TC R（T細(xì)胞抗原受體）刺激下上調(diào)。這表明，在雙CCR2i + CXCR2i治療后， CD8+TIL表達(dá)GFP增加。

總的來說，這些結(jié)果表明腫瘤浸潤髓細(xì)胞的減少和效應(yīng)因子的流入，靶向雙趨化因子受體抑制可能是增強(qiáng)PDAC化療反應(yīng)的理想治療策略。

接下來作者在已建立的原位移植PDAC腫瘤中，比較靶向治療對腫瘤的抑制情況

與對照組相比，CCR2i或CXCR2單獨(dú)靶向治療，腫瘤抑制率高，恢復(fù)了抗腫瘤免疫作用。然而，同時(shí)靶向CCR2+ TAM和CXCR2+ TAN進(jìn)一步增加腫瘤抑制率，進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤免疫，當(dāng)與FOLFIRINOX聯(lián)合使用時(shí)效果更好。

然后作者對KCKO腫瘤鼠，聯(lián)合趨化因子阻斷與FOLFIRINOX 化療治療后25天，檢測基因表達(dá)情況

發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療后免疫抑制基因的表達(dá)減少與抗腫瘤免疫和細(xì)胞溶解性T細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)的因素的增加相對應(yīng)。

最后，正如作者的結(jié)果所示，髓系阻滯后的抗腫瘤活性是通過適應(yīng)性免疫機(jī)制介導(dǎo)的，作者進(jìn)行了CD8耗竭實(shí)驗(yàn) 用IgG 做對照，結(jié)果表明，在缺乏CD8+淋巴細(xì)胞的情況下，髓系阻滯的治療效果消失了。

綜上所述，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了骨髓來源的髓細(xì)胞在介導(dǎo)PDAC免疫逃避中的重要性，并為同時(shí)靶向CCR2+ TAM和CXCR2+ TAN提供了臨床依據(jù)。

本研究的意義
在這個(gè)問題上已經(jīng)知道了什么？
· 骨髓源性髓細(xì)胞, 包括腫瘤相關(guān)的嗜中性細(xì)胞 (TAN) 和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 (TAM) 是由胰腺腺癌 (PDAC) 招募, 并促進(jìn)免疫規(guī)避。
· PDAC 生產(chǎn) CCL2 促進(jìn) CCR2+ 單核細(xì)胞外流從骨髓到腫瘤微環(huán)境, 在那里他們成為免疫抑制 TAM。
· 用小分子 CCR2 抑制劑聯(lián)合 FOLFIRINOX治療, 可防止 TAM 堆積,  PDAC 與單獨(dú)化療相比并表現(xiàn)出良好的治療反應(yīng)率。
· ELR+/CXCR2 趨化因子軸被牽連到 PDAC 介導(dǎo)的招募TAN, CXCR2 阻斷在臨床前腫瘤研究中表現(xiàn)出了希望。

新發(fā)現(xiàn)是什么？
· 在 PDAC 患者中，CCR2 抑制劑治療導(dǎo)致 CXCR2+TAN 的代償性涌入，。
· 系統(tǒng)性增加CXCR2+中性粒細(xì)胞與 PDAC 預(yù)后較差有關(guān)。
· 原位 PDAC 模型中，CXCR2 阻斷, 單獨(dú)或結(jié)合 FOLFIRINOX 化療, 防止TAN從外周血的動(dòng)員和增加效應(yīng)瘤-浸潤 T 細(xì)胞。
· 在一個(gè)原位 PDAC 模型中，重復(fù)髓樣替代，并結(jié)合 CCR2 加 CXCR2 阻斷減少總腫瘤浸潤髓細(xì)胞, 與單獨(dú)治療相比增強(qiáng)抗腫瘤免疫和化療反應(yīng)。

在可預(yù)見的將來, 它將如何影響臨床實(shí)踐？
對PDAC患者， 聯(lián)合靶向主要腫瘤-浸潤髓樣譜系可能是逆轉(zhuǎn)免疫抑制 TME 和增強(qiáng)化療反應(yīng)最佳方法。

參考文獻(xiàn)：
1.    Nywening, T.M., et al. Targeting both tumour-associated CXCR2(+) neutrophils and CCR2(+) macrophages disrupts myeloid recruitment and improves chemotherapeutic responses in pancreatic ductal adenocarcinoma. Gut 67, 1112-1123 (2018).