與批次和補(bǔ)料分批培養(yǎng)不同，連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)通過(guò)補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)去除耗竭培養(yǎng)基，維持生物反應(yīng)器內(nèi)恒定的體積，通?？蛇_(dá)到極高的細(xì)胞密度，這就意味著培養(yǎng)基灌流速率高于細(xì)胞生產(chǎn)速率，細(xì)胞需被截留在生物反應(yīng)器內(nèi)。目前市面上有不同類型的細(xì)胞截留裝置。但是，最常使用的是切向流過(guò)濾（TFF）或交替式切向流（ATF）。

早在80年代后期和90年代初，連續(xù)培養(yǎng)已被考慮用于生物制藥，彼時(shí)，連續(xù)生產(chǎn)主要用于生產(chǎn)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。但隨著對(duì)生物藥需求的增加以及市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的加劇，行業(yè)開(kāi)始尋求更高效、更靈活的工藝和設(shè)施。為解決這種新的挑戰(zhàn)，制藥行業(yè)開(kāi)始重新審視連續(xù)培養(yǎng)作為一種解決方案的可能性。

使用配置交替式切向流（ATF）過(guò)濾的攪拌罐生物反應(yīng)器進(jìn)行灌流培養(yǎng)，以進(jìn)行病毒顆粒連續(xù)生產(chǎn)時(shí)的反應(yīng)器配置（S.Gutierrez-Granados, et al. 2018）。

盡管連續(xù)培養(yǎng)的操作更加復(fù)雜，但與批次和補(bǔ)料分批相比，其優(yōu)勢(shì)也非常明顯。連續(xù)補(bǔ)加培養(yǎng)基可獲得更高的細(xì)胞密度。與此同時(shí)，可能會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)或蛋白質(zhì)生產(chǎn)的代謝副產(chǎn)物被連續(xù)去除。這通常可轉(zhuǎn)化成更高的單位體積產(chǎn)量，相應(yīng)地降低生物反應(yīng)器尺寸、降低生產(chǎn)線占地以及成本投入，而生產(chǎn)批次的大小由操作時(shí)間決定，而不是生物反應(yīng)器的大小。產(chǎn)物可連續(xù)收獲，這對(duì)于不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)是一項(xiàng)明顯的優(yōu)勢(shì)，因如其在生物反應(yīng)器滯留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能因?yàn)榕囵B(yǎng)的條件，而損失其質(zhì)量屬性。總體來(lái)說(shuō)，相比其它培養(yǎng)模式，連續(xù)培養(yǎng)可強(qiáng)化工藝，增強(qiáng)操作的靈活性，而降低成本。

過(guò)去一段時(shí)間，連續(xù)培養(yǎng)在蛋白質(zhì)和單克隆抗體生產(chǎn)上的應(yīng)用已經(jīng)得到了很大的發(fā)展，而參考原文關(guān)注了使用連續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行病毒（疫苗和病毒載體）的生產(chǎn)，以及這種培養(yǎng)模式怎樣操作和優(yōu)化，以提高基于細(xì)胞培養(yǎng)的病毒性產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量。

病毒性疫苗的連續(xù)生產(chǎn)

基于細(xì)胞培養(yǎng)的病毒性疫苗包括相對(duì)“經(jīng)典”的減毒和滅活病毒以及新一代的非感染性病毒樣顆粒（VLP）。這種多樣性也反映在其生產(chǎn)方法：一些疫苗通過(guò)感染宿主細(xì)胞生產(chǎn)，而另一些使用穩(wěn)定或瞬時(shí)異源性蛋白質(zhì)表達(dá)方法生產(chǎn)。不管哪種方法，都需要克服相應(yīng)的生產(chǎn)挑戰(zhàn)，包括提高滴度、獲得更加經(jīng)濟(jì)的工藝，以及保證產(chǎn)物質(zhì)量，后者會(huì)直接影響疫苗免疫源性和安全性。

常見(jiàn)生產(chǎn)方式（瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、病毒感染及穩(wěn)定細(xì)胞系）示意圖（S.Gutierrez-Granados, et al. 2018）。

連續(xù)培養(yǎng)為基于細(xì)胞的病毒性疫苗生產(chǎn)工藝的優(yōu)化提供了解決方案。已有關(guān)于不同連續(xù)培養(yǎng)方法的報(bào)導(dǎo)。

用于疫苗生產(chǎn)的灌流培養(yǎng)

與重組蛋白和單克隆抗體不同的是，病毒結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性妨礙了宿主細(xì)胞生產(chǎn)大量病毒的能力，所以，細(xì)胞特異性病毒產(chǎn)率通常較低。出于此原因，為細(xì)胞連續(xù)提供新鮮的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)去除代謝副產(chǎn)物，有助于提高細(xì)胞所能生產(chǎn)的病毒數(shù)量。Nikolay等在批次搖瓶中以BHK-21懸浮細(xì)胞生產(chǎn)寨卡病毒，比使用貼壁Vero細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)，產(chǎn)率要低（9x10^3 PFU/mL vs. ~10^7PFU/mL）。為提高滴度，作者使用ATF系統(tǒng)進(jìn)行了灌流培養(yǎng)。感染前，通過(guò)將灌流速率從0.15VVD提升至0.42VVD，細(xì)胞生長(zhǎng)至12x10^6cells/mL。感染后，灌流維持6天，達(dá)到3.9x10^7PFU/mL的生產(chǎn)結(jié)果。盡管相比貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞的特異性病毒產(chǎn)率仍較低，但是建立了一種用于寨卡病毒的產(chǎn)量足夠的可放大生產(chǎn)工藝。

Cervera等開(kāi)發(fā)了一種可強(qiáng)化人免疫缺陷病毒（HIV）VLP生產(chǎn)的新方法，使用重復(fù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)基置換的HEK293細(xì)胞培養(yǎng)，命名為Extended Gene Expression（EGE）。轉(zhuǎn)染后，每48小時(shí)置換培養(yǎng)基，相比72小時(shí)的批次培養(yǎng)，蛋白質(zhì)生產(chǎn)可提高8倍。而結(jié)合兩次再轉(zhuǎn)染，可提高12倍。在配有灌流的1.3L生物反應(yīng)器上成功操作了這種方法，以0.5VVD的速率置換培養(yǎng)基，使用連續(xù)灌流，細(xì)胞可生長(zhǎng)至更高的細(xì)胞密度（~16x10^6cells/mL），高于使用不連續(xù)培養(yǎng)基置換的搖瓶培養(yǎng)，同時(shí)維持VLP滴度。所以，EGE是一種可強(qiáng)化瞬時(shí)轉(zhuǎn)染工藝的非常有潛力的策略，可進(jìn)一步優(yōu)化以獲得更高的VLP滴度。

Fontana等使用穩(wěn)定的HEK293細(xì)胞系生產(chǎn)了狂犬病毒樣顆粒。作者使用5L生物反應(yīng)器，以灌流模式，培養(yǎng)細(xì)胞20天，使用旋轉(zhuǎn)濾器截留細(xì)胞。使用這種方法，培養(yǎng)密度可達(dá)到16x10^6cells/mL，相比批次模式，細(xì)胞密度翻倍。由于基于VLP的疫苗可穩(wěn)定生產(chǎn)，生物反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞越多，即直接意味著可生產(chǎn)更多的產(chǎn)物。這可降低生產(chǎn)工藝的成本，進(jìn)而顯著影響動(dòng)物疫苗的生產(chǎn)。

通過(guò)灌流克服細(xì)胞密度效應(yīng)

細(xì)胞密度效應(yīng)是一種廣泛報(bào)導(dǎo)的現(xiàn)象，即細(xì)胞在高密度（0.5-5x10^6cells/mL以上，取決于每種特定的細(xì)胞系）條件下感染或轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞特異性產(chǎn)率會(huì)顯著降低。造成這種現(xiàn)象的主要假設(shè)是在高密度條件下，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被“剝奪”，在此類條件下，細(xì)胞很難生產(chǎn)高病毒滴度。灌流已被證實(shí)有助于客服“細(xì)胞密度效應(yīng)”的限制：以灌流模式培養(yǎng)的細(xì)胞在更高的細(xì)胞密度條件下被感染或轉(zhuǎn)染，可維持細(xì)胞特異性產(chǎn)率。

Genzel等通過(guò)感染AGE和CAP細(xì)胞生產(chǎn)流感病毒，以ATF系統(tǒng)進(jìn)行灌流。AGE細(xì)胞在50x10^6cells/mL條件下感染，CAP細(xì)胞在25x10^6cells/mL條件下感染，相比低細(xì)胞密度感染，兩種情況均可維持特異性病毒產(chǎn)率，明顯克服了細(xì)胞密度效應(yīng)。Petiot等報(bào)導(dǎo)感染使用聲學(xué)過(guò)濾器灌流培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞，生產(chǎn)流感病毒。HEK293細(xì)胞在灌流中呈現(xiàn)中更加活躍的代謝狀態(tài)，從而使滴度增加10倍。Venereo-Sanchez等使用生產(chǎn)血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的可誘導(dǎo)細(xì)胞系生產(chǎn)基于VLP的流感疫苗，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Gag-GFP作為VLP的核蛋白。通過(guò)灌流培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，以在誘導(dǎo)HA和NA表達(dá)及Gag轉(zhuǎn)染前，達(dá)到高細(xì)胞密度（14x10^6cells/mL）。由于特異性病毒產(chǎn)量不受影響，相比批次培養(yǎng)，灌流培養(yǎng)的Gag-GFP和HA滴度分別增加了60倍和17倍。

病毒性疫苗的連續(xù)收獲

基于病毒的疫苗滴度也會(huì)受到收獲時(shí)間的影響。病毒通常對(duì)生物反應(yīng)器內(nèi)的理化狀態(tài)較為敏感，如果滯留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)影響其感染性。出于這個(gè)原因，如果病毒可被連續(xù)收獲，即可被立即處理或儲(chǔ)存于適合的條件下，以維持其特性。Petiot等對(duì)不同溫度條件下的流感病毒的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，觀察到，如果生產(chǎn)在35℃條件下進(jìn)行，且病毒連續(xù)收獲，并儲(chǔ)存于2-8℃，滅活率會(huì)顯著低于在37℃條件下進(jìn)行的更長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)。此外，細(xì)胞培養(yǎng)基的連續(xù)去除可避免細(xì)胞副產(chǎn)物（宿主細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)）的累積，有利于病毒特性的保持，也可簡(jiǎn)化下游工藝。

用于疫苗生產(chǎn)的其它類型的連續(xù)培養(yǎng)

兩階段連續(xù)生物反應(yīng)器是以連續(xù)模式生產(chǎn)病毒的另一種替代方法。該系統(tǒng)由物理性分離的兩個(gè)串聯(lián)生物反應(yīng)器組成，一個(gè)用于細(xì)胞生長(zhǎng)，一個(gè)用于病毒生產(chǎn)階段。詳細(xì)介紹，請(qǐng)參考原文。

病毒載體的連續(xù)生產(chǎn)

盡管過(guò)去幾年對(duì)病毒載體的興趣在不斷增加，但對(duì)生產(chǎn)工藝的關(guān)注卻不多。需要開(kāi)發(fā)高效、可放大、穩(wěn)健且可重復(fù)的生產(chǎn)工藝，以滿足基因治療行業(yè)對(duì)病毒載體不斷增加的需求，同時(shí)保證合理的成本。最常使用的系統(tǒng)仍然是批次或補(bǔ)料分批，且多數(shù)基于貼壁細(xì)胞。但是，為克服這些策略的限制，灌流受到了越來(lái)越多的關(guān)注。病毒載體可通過(guò)感染、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或生產(chǎn)細(xì)胞系生產(chǎn)。使用灌流培養(yǎng)模式的不同系統(tǒng)已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。詳細(xì)介紹，請(qǐng)參考原文。

使用懸浮細(xì)胞的病毒載體灌流生產(chǎn)

慢病毒載體

慢病毒的半衰期為4-16小時(shí)，所以對(duì)于其生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，批次或補(bǔ)料分批不是非常有吸引力的選擇?！凹佟惫嗔骺捎糜诼《镜男∫?guī)模生產(chǎn)，將轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度從1x10^6cells/mL提升到5x10^6cells/mL，同時(shí)維持2TU/cell的恒定產(chǎn)率。轉(zhuǎn)染前后，以1RV/day的置換量，離心置換培養(yǎng)基。該方法轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器規(guī)模時(shí)，轉(zhuǎn)染后進(jìn)行灌流，可收獲慢病毒，去除殘留的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，并為轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提供額外的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

最近，Manceur等使用可誘導(dǎo)HEK293生產(chǎn)細(xì)胞系，生產(chǎn)慢病毒載體。實(shí)驗(yàn)測(cè)試了兩個(gè)不同的灌流策略。在第一種策略中，在整個(gè)生物工藝過(guò)程中（誘導(dǎo)前/后）使用基礎(chǔ)商業(yè)培養(yǎng)基進(jìn)行灌流。在第二種策略中，使用強(qiáng)化的培養(yǎng)基達(dá)到目標(biāo)高細(xì)胞密度，并在誘導(dǎo)后開(kāi)始灌流模式。使用灌流策略，病毒滴度達(dá)到8x10^10TU/L，是批次模式的15倍。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

灌流也被用于逆轉(zhuǎn)錄病毒的生產(chǎn)，使用懸浮馴化的293GPG包裝細(xì)胞。使用3L生物反應(yīng)器灌流培養(yǎng)，結(jié)果顯示，相比批次模式，莫洛尼小鼠白血病病毒（MoMLV）病毒顆粒滴度增加2倍（2.3x10^7IVP/mL）。Grieger等測(cè)試了從懸浮培養(yǎng)基中連續(xù)收獲rAAV的方法，相比批次對(duì)照組，AAV8和AAV9分別增加了6.5倍和4.8倍。

腺病毒載體

腺病毒載體生產(chǎn)時(shí)，如以批次模式進(jìn)行，在高細(xì)胞濃度條件下，會(huì)觀察到細(xì)胞密度效應(yīng)。已經(jīng)研究過(guò)不同的方法，以規(guī)避這個(gè)問(wèn)題，例如在轉(zhuǎn)染前后置換培養(yǎng)基以及通過(guò)補(bǔ)料分批優(yōu)化批次結(jié)果。但灌流是克服腺病毒生產(chǎn)中細(xì)胞密度效應(yīng)的最可行的策略。在用于重組腺病毒的293S細(xì)胞培養(yǎng)中，為提高細(xì)胞密度，使用TFF設(shè)備，以灌流模式進(jìn)行了腺病毒的生產(chǎn)。在1VVD的灌流速率條件下，10天內(nèi)，293S細(xì)胞生長(zhǎng)至14x10^6cells/mL。用于腺病毒生產(chǎn)時(shí)，三個(gè)293細(xì)胞培養(yǎng)以1VVD的灌流速率，平行進(jìn)行，在平均密度8x10^6cells/mL時(shí)感染，即相當(dāng)于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。一個(gè)培養(yǎng)設(shè)置為37℃，另兩個(gè)設(shè)置為35℃。結(jié)果是，在37℃條件下，可生產(chǎn)3.2x10^9感染性病毒顆粒（IVP）/mL，在35℃條件下為7.8x10^9IVP/mL，至少是批次對(duì)照組的5.5倍。

ATF灌流設(shè)備也被測(cè)試用于溶瘤性腺病毒載體（ONYX-411）的生產(chǎn)，使用HeLaS3細(xì)胞系。生物反應(yīng)器以批次模式開(kāi)始，當(dāng)乳酸濃度超過(guò)1.3g/L時(shí)，開(kāi)始灌流。補(bǔ)液策略基于維持葡萄糖濃度高于2g/L，且乳酸濃度低于2g/L。每天兩次檢查灌流速率，以滿足細(xì)胞培養(yǎng)要求。培養(yǎng)感染后，停止灌流3小時(shí)，以避免“洗掉”用于感染的病毒。結(jié)果顯示，補(bǔ)料分批和灌流培養(yǎng)的平均細(xì)胞特異性病毒產(chǎn)率相當(dāng)，分別為3.1x10^4VP/cell和3.3x10^4VP/cell。但是收獲時(shí)，灌流培養(yǎng)中檢測(cè)到的平均病毒滴度約為補(bǔ)料分批培養(yǎng)的4倍，因?yàn)樵诟腥緯r(shí)，活細(xì)胞密度差為4倍。

總結(jié)和展望

隨著新一代基因治療臨床試驗(yàn)數(shù)量的增加，以及新的、基于細(xì)胞的疫苗的不斷發(fā)展，在未來(lái)的一段時(shí)間內(nèi)，病毒顆粒生產(chǎn)技術(shù)還將繼續(xù)其革新，以作為向患者有效、安全地提供新型治療方法的關(guān)鍵部分。為滿足這方面的預(yù)期，必需面對(duì)一些挑戰(zhàn)。首先，需要降低生產(chǎn)的成本，以使工藝更具經(jīng)濟(jì)性，更有行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力，以獲得患者“負(fù)擔(dān)得起”的治療方式。其次，需要建立更加靈活的生產(chǎn)設(shè)施，以滿足更加多樣化的管線的要求。一方面，建立針對(duì)可能的、新病毒的爆發(fā)的快速反應(yīng)，生產(chǎn)所需的疫苗，是必然的要求。而另一方面，藥物也在向更加個(gè)體化的方向發(fā)展，待治療的患者群體更小，治療更加“精準(zhǔn)”。這也就意味著未來(lái)的生產(chǎn)設(shè)施需具有生產(chǎn)多個(gè)藥物的能力，而每個(gè)的生產(chǎn)量則可能會(huì)降低。新技術(shù)的發(fā)展需能相應(yīng)這些挑戰(zhàn)。

生物制藥行業(yè)的生產(chǎn)模式的轉(zhuǎn)變正在發(fā)生，批次和補(bǔ)料分批模式正逐漸被連續(xù)生產(chǎn)取代。使用連續(xù)技術(shù)獲得的病毒顆粒生產(chǎn)的成功案例、新的監(jiān)測(cè)和控制技術(shù)的發(fā)展以及連續(xù)下游工藝的整合，將極大的促進(jìn)連續(xù)平臺(tái)的鞏固，以用于作為治療性藥物的病毒的生產(chǎn)和純化。

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參考原文：

S.Gutierrez-Granados, F.Godia, L.Cervera, Continuous manufacturing of viral particles. Current Opinion In Chemical Engineering. 2018, 22: 107-114.