談?wù)摰街毕低椿蚍治龅臅r(shí)候，大部分教程都是介紹OrthoMCL，這是2003年發(fā)表的一個(gè)工具，目前的引用次數(shù)已經(jīng)達(dá)到了3000多，但這個(gè)軟件似乎在2013年之后就不在更新，而且安裝時(shí)還需要用到MySQL（GitHub上有人嘗試從MySQL轉(zhuǎn)到sqlite）。

而OrthoFinder則是2015年出現(xiàn)的軟件，目前已有400多引用。該軟件持續(xù)更新，安裝更加友好，因此我決定使用它來(lái)做直系同源基因的相關(guān)分析。

OrthoFinder能做什么？

OrthoFinder: solving fundamental biases in whole genome comparisons dramatically improves orthogroup inference accuracy提到，它的優(yōu)點(diǎn)就是比其他的直系同源基因組的推斷軟件準(zhǔn)確，并且速度還快。

此外他還能分析所提供物種的系統(tǒng)發(fā)育樹，將基因樹中的基因重復(fù)事件映射到物種樹的分支上，還提供了一些比較基因組學(xué)中的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

OrthoFinder的分析過(guò)程

OrthoFinder的分析過(guò)程分為如下幾步:

1. BLAST all-vs-all搜索。使用BLASTP以evalue=10e-3進(jìn)行搜索，尋找潛在的同源基因。(除了BLAST, 還可以選擇DIAMOND和MMSeq2)

2. 基于基因長(zhǎng)度和系統(tǒng)發(fā)育距離對(duì)BLAST bit得分進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

3. 使用RBNHs確定同源組序列性相似度的閾值

4. 構(gòu)建直系同源組圖(orthogroup graph)，用作MCL的輸入

5. 使用MCL對(duì)基因進(jìn)行聚類，劃分直系同源組

OrthoFinder2在OrthoFinder的基礎(chǔ)上增加了物種系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，流程如下

1. 為每個(gè)直系同源組構(gòu)建基因系統(tǒng)發(fā)育樹

2. 使用STAG算法從無(wú)根基因樹上構(gòu)建無(wú)根物種樹

3. 使用STRIDE算法構(gòu)建有根物種樹

4. 有根物種樹進(jìn)一步輔助構(gòu)建有根基因樹

基于Duplication-Loss-Coalescent 模型，有根基因樹可以用來(lái)推斷物種形成和基因復(fù)制事件，最后記錄在統(tǒng)計(jì)信息中。

軟件使用

在解壓縮的OrthoFinder文件目錄下(安裝見最后)有一個(gè) ExampleData, 里面就是用于測(cè)試的數(shù)據(jù)集。

OrthoFinder的基本使用就是如此簡(jiǎn)單，而且最終效果也基本符合需求。

如果你想根據(jù)多序列聯(lián)配(MSA)結(jié)果按照極大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，那么你需要加上 -M msa。這樣結(jié)果會(huì)更加準(zhǔn)確，但是代價(jià)就是運(yùn)行時(shí)間會(huì)更久，這是因?yàn)?OrthoFinder要做10,000 - 20,000個(gè)基因樹的推斷。

OrthoFinder默認(rèn)用mafft進(jìn)行多序列聯(lián)配，用fasttree進(jìn)行進(jìn)化樹推斷。多序列聯(lián)配軟件還支持muscle, 進(jìn)化樹推斷軟件還支持iqtree, raxml-ng, raxml。例如參數(shù)可以設(shè)置為 -M msa-A mafft-T raxml.

并行化參數(shù): -t參數(shù)指定序列搜索時(shí)的線程數(shù)， -a指的是序列搜索后分析的CPU數(shù)。

軟件細(xì)節(jié)

OrthoFinder提供了 config.json可以調(diào)整不同軟件的參數(shù)，如下是BLASTP。

OrthoFinder默認(rèn)使用 DendroBLAST發(fā)育樹，也就是根據(jù)序列相似度推斷進(jìn)化關(guān)系。這是作者推薦的方法，在損失部分準(zhǔn)確性的前提下提高了運(yùn)算效率。當(dāng)然你可以用 -M msa從多序列比對(duì)的基礎(chǔ)上進(jìn)行基因樹構(gòu)建。如果你先用了默認(rèn)的 DendroBLAST，想測(cè)試下傳統(tǒng)的MSA方法，那么也不需要重頭運(yùn)行，因?yàn)橛幸粋€(gè) -b參數(shù)可以在復(fù)用之前的比對(duì)結(jié)果。

在物種發(fā)育樹的推斷上，OrthoFinder使用STAG算法，利用所有進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，而非單拷貝基因。此外當(dāng)使用MSA方法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹推斷時(shí)，OrthoFinder為了保證有足夠多的基因(大于100)用于分析，除了使用單拷貝基因外，還會(huì)挑選大部分是單拷貝基因的直系同源組。這些直系同源組的基因前后相連，用空缺字符表示缺失的基因，如果某一列存在多余50%的空缺字符，那么該列被剔除。最后基于用戶指定的建樹軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。結(jié)果在'WorkingDirectory/SpeciesTree_unrooted.txt'

使用STRIDE算法從無(wú)根樹中推斷出有根樹, 結(jié)果就是'SpeciesTree_rooted.txt'.

結(jié)果文件

運(yùn)行結(jié)束后，會(huì)在 ExampleData里多出一個(gè)文件夾， Results_Feb14, 其中Feb14是我運(yùn)行的日期

直系同源組相關(guān)結(jié)果文件，將不同的直系同源基因進(jìn)行分組

• Orthogroups.csv：用制表符分隔的文件，每一行是直系同源基因組對(duì)應(yīng)的基因。

• Orthogroups.txt: 類似于Orthogroups.csv，只不過(guò)是OrhtoMCL的輸出格式

• Orthogroups_UnassignedGenes.csv: 格式同Orthogroups.csv，只不過(guò)是物種特異性的基因

• Orthogroups.GeneCount.csv：格式同Orthogroups.csv, 只不過(guò)不再是基因名信息，而是以基因數(shù)。

直系同源相關(guān)文件，分析每個(gè)直系同源基因組里的直系同源基因之間關(guān)系，結(jié)果會(huì)在 Orthologues_Feb14文件夾下，其中 Feb14是日期

• Gene_Trees: 每個(gè)直系同源基因基因組里的基因樹

• ReconGeneTrees：使用OrthoFinder duplication-loss coalescent 模型進(jìn)行發(fā)育樹推斷

• PotentialRootedSpecies_Trees: 可能的有根物種樹

• SpeciesTree_rooted.txt: 從所有包含STAG支持的直系同源組推斷的STAG物種樹

• SpeciesTreerootednode_labels.txt: 同上，只不過(guò)多了一個(gè)標(biāo)簽信息，用于解釋基因重復(fù)數(shù)據(jù)。

比較基因組學(xué)的相關(guān)結(jié)果文件：

• Orthogroups_SpeciesOverlaps.csv： 不同物種間的同源基因的交集

• SingleCopyOrthogroups.txt： 單基因拷貝組的編號(hào)

• Statistics_Overall.csv：總體統(tǒng)計(jì)信息

• Statistics_PerSpecies.csv：分物種統(tǒng)計(jì)信息

STAG是一種從所有基因推測(cè)物種樹的算法，不同于使用單拷貝的直系同源基因進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建。

一些重要概念:

• Species-specific orthogroup: 一個(gè)僅來(lái)源于一個(gè)物種的直系同源組

• Single-copy orthogroup: 在直系同源組中，每個(gè)物種里面只有一個(gè)基因。我們會(huì)用單拷貝直系同源組里的基因推斷物種樹以及其他數(shù)據(jù)分析。

• Unassigned gene: 無(wú)法和其他基因進(jìn)行聚類的基因。

• G50和O50，指的是當(dāng)你直系同源組按照基因數(shù)從大到小進(jìn)行排列，然后累加，當(dāng)加入某個(gè)組后，累計(jì)基因數(shù)大于50%的總基因數(shù)，那么所需要的直系同源組的數(shù)目就是O50，該組的基因樹就是G50.

Orthogroups, Orthologs 和 Paralogs 這三個(gè)概念推薦看圖理解。

如何安裝？

最快的方法

OrthoFinder可以通過(guò)conda安裝，建議為它新建一個(gè)虛擬環(huán)境

conda create -n orthofinder orthofinder=2.2.7

如果你愿意折騰

你先得安裝它的三個(gè)依賴工具: MCL, FastME, DIAMOND/MMseqs2/BLAST+

MCL有兩種安裝方式，最簡(jiǎn)單的就是用 sudo pat-getinstall mcl, 但是對(duì)于大部分人可能沒有root權(quán)限，因此這里用源代碼編譯。http:///mcl/

之后是MMseqs2, 一個(gè)蛋白搜索和聚類工具集，相關(guān)文章發(fā)表在NBT, NC上。GitHub地址為https://github.com/soedinglab/MMseqs2

wget https://github.com/soedinglab/MMseqs2/releases/download/3-be8f6/MMseqs2-Linux-AVX2.tar.gz
tar xzf MMseqs2-Linux-AVX2.tar.gz
mv mmseqs2 ~/opt/biosoft/

最后安裝FastME, 這是一個(gè)基于距離的系統(tǒng)發(fā)育樹推斷軟件。在http://www./fastme/binaries.php下載，上傳到服務(wù)器