  ChIP全稱是染色質(zhì)免疫共沉淀，就是用抗體吊取用甲醛交聯(lián)過的染色質(zhì)中的特異轉(zhuǎn)錄因子或者發(fā)生修飾的組蛋白，然后，用磁珠，瓊脂糖珠，或者抗體包被板等策略將轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白上交聯(lián)上的DNA洗脫下來，然后去測序。說起來很簡單，但是，這里邊有很多“坑”，我們一一細(xì)數(shù)一下。  
ChIP實驗最初是為細(xì)胞開發(fā)的，所以細(xì)胞水平的ChIP實驗體系較為成熟，可以自己配試劑，也可以買成熟的試劑盒，國產(chǎn)的進(jìn)口的都有很多選擇，效果都差不多。但是組織水平就不一樣了，如果你選擇的是用組織去做ChIP-seq，那么你要首先評估一下自己的組織是什么質(zhì)地的： 1.如果是蛋白分泌器官，那么，你就需要很大的起始量，而且做處理組織的時候，要徹底勻漿分多次將目標(biāo)組織懸液洗脫下來。 2.如果你是很純的組織，比如一些臟器，沒有太多的細(xì)胞核以外的蛋白質(zhì)，那么只需要勻漿一次，一次性就可以洗脫下來足夠數(shù)量的組織懸液。 組織材料是否新鮮也對實驗有一定影響。冷凍過的組織，可以做ChIP嗎？答案是，可以。我試過用凍了4年的組織去做ChIP依然ChIP下來DNA，但是，這種還是不建議的，ChIP下來的DNA量會變少，而且需要3-5倍于新鮮組織的組織起始量。最好選用新鮮的組織去做ChIP，不要冷凍最好了。想想我們提取核蛋白推薦的是什么材料。  ChIP實驗步驟非常多，周期較長，1-3天不等吧。因此，要涉及到哪幾步是可以停下來的，畢竟我們都是凡夫俗子，不可能不吃不喝連干好幾天吧？不論是自己配的試劑還是用的試劑盒，可以停下來的時間節(jié)點分別是：
這兩步停頓的時間應(yīng)該基本夠我們?nèi)コ詡€飯之類的，還有就是抗體孵育，一般是過夜，因為通常情況下，做到這一步應(yīng)該就晚上了，不過經(jīng)過測試，孵育4個小時，和過夜幾乎沒有差別。大家可以靈活掌握。 再說一下ChIP的重難點，破碎！?。?/span>這幾乎決定了ChIP的成敗。剛剛做了幾百個ChIP的我的建議，應(yīng)該比較中肯。 1.接觸式的破碎儀，往往是傻瓜式的操作，插入，破碎兩步走。唯一需要摸索的就是振幅，這種機(jī)器往往不需要很長的破碎時間（5分鐘以內(nèi)），時間久了發(fā)熱很難控制，因為這種機(jī)器比較簡陋，控溫往往是用冰塊之類的。 2.非接觸式的，這種設(shè)備，功率很有限，所以設(shè)計就很重要了，不同品牌參差不齊。我們實驗室的co牌設(shè)備（具體哪個牌子請大家后臺回復(fù)，畢竟我們不是收錢打廣告）就是行業(yè)典范了，設(shè)置起來和普通的超聲波不太一樣，原理也不太一樣，但是效果非常好，但是缺點也比較明顯，需要用他們配備的耗材，比較貴。而其他一些照貓畫虎的設(shè)備的效果就差很多了，因為設(shè)計上的問題，導(dǎo)致作用到樣本上的功率很有限，如果不配套特殊的耗材，可能根本達(dá)不到我們需要的破碎要求。 1.破碎功率的選擇非常重要，因為，根據(jù)我的摸索，功率率先決定你破碎片段的大小，時間決定條帶的集中程度（都是沒有發(fā)表過的高清無碼大圖啊，我沒有加水印，但是希望要盜圖的盆友請自重哈）。  破碎時間越長條帶越集中 功率越大主帶越小  2.破碎檢測，建議最好是提出來DNA去檢測，而不是直接用組織懸液去跑膠，這樣會使條發(fā)生偏移，或者顯示不清楚。而且，這一步還有一個重要的作用就是，根據(jù)你取得懸液的體積和DNA的總量來推算你的破碎樣本中有多少DNA，進(jìn)而決定每個樣品要上多少的懸液去ChIP。 盡可能選擇單抗，最好是ChIP級的抗體，抗體特異性不夠的話，會導(dǎo)致大量的假陽性出現(xiàn)。 最后，選擇磁珠，瓊脂糖珠還是抗體包被板。這里推薦磁珠。磁珠不需要離心，這可以減少ChIP DNA的損失。缺點就是磁珠要貴一點點。而抗體包被板呢？操作起來較為簡單，試驗周期較短，但是，DNA得率方面也是不那么穩(wěn)定。 |
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